雌激素受體α、β在雌性山羊頸動脈體的分布

杜宜楠，趙建帥，金秀芳，徐永平，趙泓淙，陳彥至，姜藝媛

（西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100）

雌激素（ertrogen）是一類主要由卵巢和胎盤產(chǎn)生并分泌的類固醇激素，以雌二醇，雌三醇以及雌酮為主，主要參與雌性動物生殖器官發(fā)育的調控以及第二性征的維持。研究表明，雌激素除了參與對生殖系統(tǒng)的調控作用外，也參與非生殖器官功能的調節(jié)，如對消化系統(tǒng)[1]、神經(jīng)系統(tǒng)[2]以及心血管系統(tǒng)[3]的調節(jié)作用。雌激素的生物學效應由特異性的雌激素受體（estrogen receptor，ER）所介導，經(jīng)典的ER主要包括α和β兩種亞型，雌激素與ER結合可引發(fā)基因組效應或非基因組效應從而影響細胞的功能。研究表明，在牛主動脈的內皮細胞[4]、大鼠心臟的心肌細胞和成纖維細胞[5]以及人冠狀動脈內皮細胞[6]內均有ER的表達。Simeriy等[7]在小鼠下丘腦的腹外側核、腹內側核、室旁核以及弓狀核等與心血管活動調節(jié)有關的中樞核團內也檢測到ER的mRNA的分布。王志豪等[8]則采用免疫組織化學SP法證明ER在雌性山羊星狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中廣泛分布。以上資料表明，雌激素可以通過直接作用于心血管系統(tǒng)的ER或通過中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)內的ER間接作用于心血管系統(tǒng)，參與對心血管系統(tǒng)功能活動的調節(jié)。

頸動脈體（carotid body，CB）是位于頸總動脈分叉后緣的外周化學性呼吸感受器，可通過感受血液中氧分壓、CO2分壓以及pH的化學變化并將這些信息傳遞至中樞延髓內，進而調節(jié)心血管的活動[9-11]。那么CB是否具有接受雌激素作用的條件呢？雌激素是否可以通過影響CB的反射活動，進而對心血管活動產(chǎn)生影響？本試驗采用免疫組織化學SP法檢測了雌性山羊CB中ERα與ERβ的分布特點，為探索雌激素能否通過影響外周化學感受器CB對心血管活動進行調節(jié)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物健康的成年非妊娠雌性奶山羊5只。

1.2 試驗材料內源性生物素阻斷試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）；即用型免疫組化SP超敏試劑盒（兔）（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）；兔抗鼠ERα多克隆抗體（武漢博士德生物技術有限公司）；兔抗鼠ERβ多克隆抗體（武漢博士德生物技術有限公司）；DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）；德國Leica石蠟切片機；Montic生物顯微鏡。

1.3 石蠟切片制備及SP免疫組化染色過程將山羊保定，陸眠寧麻醉，頸總動脈放血處死，從寰枕關節(jié)處取下羊頭，立即沿兩側頸動脈斷端分離至分叉處并迅速取下后緣的CB，投入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定24 h。固定好的組織經(jīng)修塊，流水沖洗12 h后，采用梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制成包埋塊。包埋塊經(jīng)修整后石蠟切片機切片，片厚5 μm，40℃恒溫水浴鍋展片，載玻片貼片，37℃烘箱烘干。切片分為3套，第一套用于ERα與ERβ免疫組織化學SP法染色：切片烘干后經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟復水，置于0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖溶液中進行熱抗原修復，沸水浴20 min后在自然條件下靜置降至室溫，滴加內源性生物素阻斷劑A、B液各孵育15 min，之后按照免疫組織化學SP法試劑盒說明書，先后滴加試劑盒中的A液和B液，室溫各孵育20 min，而后滴加兔抗羊ERα與兔抗羊ERβ多克隆抗體（工作濃度均為1:300），4℃冰箱孵育過夜，次日取出復溫，先后滴加試劑盒中的C液與D液，室溫各孵育20 min。以上各步驟之間均用PBS磷酸鹽緩沖液充分洗滌3次，每次5 min。避光條件下滴加新配置的DAB顯色液顯色5 min左右，待呈色反應完全后用蒸餾水終止顯色反應，后經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明，使用中性樹膠封固。第二套切片做免疫組織化學SP法染色后用蘇木素復染進行細胞核定位；切片終止DAB顯色后用蘇木素復染1 min，1%鹽酸乙醇分化后流水沖洗5 min，再進行常規(guī)脫水透明，封片。第三套作為免疫組織化學SP法染色的陰性對照組；使用PBS磷酸鹽緩沖液代替兔抗羊ER多克隆抗體，其余步驟相同。

1.4 圖像分析切片晾干后使用Motic數(shù)碼顯微鏡觀察拍照，每只山羊分別選取連續(xù)的5張切片，每張切片隨機選取5個視野，在相同條件下觀察拍照。用江蘇捷達高清晰圖像分析系統(tǒng)進行分析，分別計算出CB中ERα與ERβ免疫陽性物質的相對表達量（相對表達量＝光鏡倍數(shù)×陽性面積×平均光密度/像素）。用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±方差”表示。

2 結果

2.1 頸動脈體免疫組織化學SP法染色結果見圖1和圖2。

試驗組蘇木精復染后可見細胞核呈藍色，實質細胞與部分間質呈不同程度的陽性著色。空白對照組經(jīng)蘇木精復染后可見藍色細胞核，無陽性著色，表明ER的SP免疫組化染色無非特異性著色。根據(jù)染色程度的不同，參照黃雙等[12]的方法，將染色結果分為四個等級：強陽性，染色呈棕黃色或棕褐色；中等陽性，染色呈黃色；弱陽性，染色呈淡黃色；陰性，無著色。

圖1 雌性山羊頸動脈體ERα免疫組織化學SP法染色Fig.1 Immunohistochemical SP staining of ERα of the CB of female goat

圖2 雌性山羊頸動脈體ERβ免疫組織化學SP法染色Fig.2 Immunohistochemical SP staining of ERβ of the CB of female goat

免疫組織化學結果顯示，在CB中ERα與ERβ的免疫陽性產(chǎn)物廣泛分布，在球細胞、支持細胞、血管內皮細胞、神經(jīng)纖維及結締組織均有不同程度的陽性或弱陽性產(chǎn)物分布。其中ERα免疫陽性產(chǎn)物在球細胞的細胞核內染色最強，為棕黃色，呈強陽性；部分球細胞的細胞質著色呈黃色，為中等陽性；在間質組織中無著色或有淡黃色顆粒，呈陰性或弱陽性表達。而ERβ免疫陽性產(chǎn)物在球細胞的細胞膜染色最強，呈棕褐色，為強陽性；大部分球細胞細胞質中著色呈黃色，為中等陽性；而球細胞細胞核內陽性反應產(chǎn)物呈淡黃色或無著色，為弱陽性或陰性。在間質組織中無著色或有淡黃色顆粒，呈陰性或弱陽性表達。此外在穿插于實質細胞群和間質組織之間的微血管上的血管內皮細胞中也有ERβ免疫陽性產(chǎn)物分布，呈黃色，為中等陽性表達。

2.2 頸動脈體ERα和ERβ的相對表達量結果見表1和表2。

表1 雌性山羊頸動脈體頸動脈體細胞中ERα和ERβ的相對表達量Table 1 Relitive expression of ERα and ERβ of the CB of female goat

圖像分析顯示在雌性山羊CB中ERα免疫陽性產(chǎn)物在球細胞的相對表達量為13.072±7.779，與非球細胞結構的相對表達量（3.454±1.788）相比，差異顯著（P＜0.05）。ERβ免疫陽性產(chǎn)物在球細胞的相對表達量為20.756±3.160，與非球細胞結構的相對表達量（3.473±1.009）相比，差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

雌激素是一類具有廣泛生物學效應的類固醇激素，主要由卵巢和胎盤分泌產(chǎn)生，除了對生殖系統(tǒng)發(fā)揮調節(jié)作用之外，也參與如對消化道損傷的保護作用[1],對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及保護作用[2]，對心血管系統(tǒng)活動的調節(jié)作用[3]等非生殖系統(tǒng)的功能活動。雌激素生物學效應的產(chǎn)生依賴于ER的介導，經(jīng)典的ER包括ERα與ERβ兩種亞型，二者均是細胞內配基激活的轉錄因子，通過引發(fā)雌激素的經(jīng)典調節(jié)途徑發(fā)揮基因調節(jié)作用，即雌激素首先與ER結合并二聚化形成二聚體，再與位于靶基因啟動子上的雌激素作用元件相互識別并結合，從而啟動該靶基因的轉錄，發(fā)揮調節(jié)作用[13-15]。Kim等[4]的研究發(fā)現(xiàn)ERα在牛主動脈的內皮細胞內廣泛分布。Grohé C等[5]則在離體培養(yǎng)的大鼠心臟的心肌細胞和成纖維細胞內檢測到ER的mRNA的表達。杜志軍等[16]發(fā)現(xiàn)生理濃度的雌激素持續(xù)刺激人臍動脈環(huán)內皮細胞可產(chǎn)生顯著的舒張作用。Tanabe等[17]的研究表明17-β-雌二醇可顯著抑制離體豚鼠心室肌細胞外向K+電流從而延長其動作電位時程（ADP）。Karas RH等[18]發(fā)現(xiàn)雌激素可通過促進血管內皮細胞釋放NO減少血管細胞粘附分子（VCAM）的形成，抑制血管內皮細胞的粘附作用，從而抑制動脈粥樣硬化的形成，并且這種作用是完全由分布于心血管系統(tǒng)的ER所介導的。以上研究結果表明雌激素可以通過分布在心血管系統(tǒng)中的ER對心血管功能的活動產(chǎn)生直接的調控作用。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)ER在下丘腦的腹外側核、腹內側核、室旁核以及弓狀核等與心血管活動調節(jié)有關的中樞核團均有表達[7]。Saleh MC等[19]的研究表明在孤束核和延髓頭端腹外側區(qū)注射小劑量的17-β-雌二醇可明顯降低動脈血壓，在疑核注射小劑量的17-β-雌二醇則可顯著降低心率。Beyer等[20]的研究表明雌激素可以直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元上的ER，通過改變細胞膜以及細胞內的信號轉導途徑影響神經(jīng)遞質的傳遞，進而改變神經(jīng)元的功能。提示雌激素可以通過調節(jié)控制心血管系統(tǒng)的中樞活動間接調節(jié)心血管的活動。在外周神經(jīng)系統(tǒng)，王志豪等[8]采用免疫組織化學SP法證明ERα與ERβ在雌性山羊星狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中廣泛分布，星狀神經(jīng)節(jié)是支配心臟以及頭頸和前肢血管的主要交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元胞體聚集區(qū)，ERα與ERβ在星狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的廣泛分布提示雌激素可通過對自主神經(jīng)的調節(jié)作用間接影響心血管活動的功能。以上資料表明雌激素可以通過對心血管系統(tǒng)的直接作用，或者通過對中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及自主神經(jīng)的間接作用等多條途徑完成對心血管功能活動的調節(jié)。

CB是位于頸總動脈后緣的一種重要的外周化學性感受器，可以感受動脈血液化學信息的改變，并將這些信息傳遞到心血管中樞以使機體對心血管系統(tǒng)的活動做出適應性調整。CB的感受器細胞主要為擁有豐富突觸聯(lián)系并具備神經(jīng)內分泌功能的球細胞，可以合成并分泌多種神經(jīng)遞質和肽能神經(jīng)調質，調節(jié)頸動脈體的化學感受功能。研究表明球細胞與竇神經(jīng)的傳入神經(jīng)纖維末梢直接構成突觸聯(lián)系，在血液氧分壓或CO2分壓等改變的刺激下即可釋放興奮性神經(jīng)遞質并作用于附近的傳入神經(jīng)纖維末梢，引起竇神經(jīng)興奮，并將神經(jīng)沖動經(jīng)孤束核換元后傳遞至迷走神經(jīng)背核以及下丘腦等處，引起呼吸和心臟的活動變化[9-11]。本試驗的研究結果顯示，ERα與ERβ的免疫陽性產(chǎn)物均廣泛分布于CB的球細胞。其中，ERα在球細胞的相對表達量顯著高于非球細胞結構（P＜0.05），而ERβ在球細胞的相對表達量極顯著高于非球細胞結構（P＜0.01）。以上結果說明，CB的球細胞是雌激素作用的主要靶點，CB對雌激素作用具備基本反應條件，提示雌激素可能通過作用于分布在CB球細胞上的ER影響其神經(jīng)遞質的合成和釋放，進而影響實質細胞群與心血管中樞之間的信息傳遞，從而對心血管系統(tǒng)的功能活動產(chǎn)生間接的調節(jié)作用。此外本試驗的研究結果表明ERβ的免疫陽性產(chǎn)物在穿插于實質細胞群和間質組織之間的微血管內皮細胞有中等程度的分布，提示雌激素也可以通過影響CB的微循環(huán)進而調節(jié)CB的功能活動。

4 結論

ERα與ERβ的免疫陽性產(chǎn)物在雌性山羊CB中廣泛分布且強陽性產(chǎn)物主要集中在球細胞。表明CB中的球細胞是雌激素作用的主要靶點，提示雌激素可能通過作用于分布在CB球細胞上的ER，對心血管系統(tǒng)的功能活動產(chǎn)生神經(jīng)途徑的調節(jié)作用，為闡明雌激素的非生殖調控作用提供了依據(jù)。

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