白細(xì)胞介素23受體基因多態(tài)性與膀胱癌的相關(guān)性研究*

唐鐵龍 黃靜 譚春林 鄒兵 付劍 李鑫(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科, 四川 南充 637000)

美國(guó)膀胱癌預(yù)計(jì)每年有72570例新發(fā)病例和15210例癌癥死亡病例[1]。就整體癌癥發(fā)病率而言, 膀胱癌排名第九, 估計(jì)全球每年有356600例新發(fā)病例。雖然有證據(jù)表明, 膀胱癌是一種多基因疾病, 受種族、環(huán)境、遺傳和飲食因素等影響, 但膀胱癌的病因仍不明確。留置尿管和慢性膀胱發(fā)炎是增加膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)的兩大因素。膀胱癌患者的間質(zhì)細(xì)胞中存在炎性浸潤(rùn), 但在健康對(duì)照組中不存在[2]。此外, 炎癥基因包括IL-6和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)基因多態(tài)性與膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)、治療反應(yīng)和生存率相關(guān)[3]。個(gè)體炎癥反應(yīng)的差別可以解釋腫瘤分級(jí)分期相似的患者在病情進(jìn)展和治療反應(yīng)上存在的不小差異。這提示炎癥可能在膀胱癌中扮演著重要角色。

白細(xì)胞介素23(IL-23)作為新近發(fā)現(xiàn)的一種異二聚體細(xì)胞因子, 由p19和IL-12的p40亞基組成。另外, IL-23R是由IL-23R亞基和IL-12Rb1亞基組成, 并與IL-12R共享亞基[4]。IL-23R基因位于1號(hào)染色體(1p32.1-p31.2), 編碼IL-23R的一個(gè)亞基, 被認(rèn)為是炎性疾病和自身免疫性疾病的易感基因, 如炎性腸病、銀屑病、Graves眼病、強(qiáng)直性脊柱炎、股骨頭壞死[5]、多發(fā)性硬化[6-7]。最近, Langowski等[8]報(bào)導(dǎo)了IL-23在IL-23 p19缺陷小鼠炎癥促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。也有報(bào)道指出IL-23R基因多態(tài)性與惡性疾病有關(guān)[9-12]?；谶@些數(shù)據(jù)和IL-23R重要的生物學(xué)功能, 我們假設(shè)IL-23R遺傳變異可能與膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián), 采用基于醫(yī)院的病例-對(duì)照研究方法分析IL-23R基因多態(tài)性與中國(guó)人群膀胱癌易感性之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究取得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn), 每個(gè)患者術(shù)前簽署知情同意書。根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)(病理診斷)和排除標(biāo)準(zhǔn)(存在兩種或多種惡性腫瘤), 共納入自2006年1月～2012年12月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院接受治療的膀胱移行細(xì)胞癌(TCC)患者226例為病例組；組織病理學(xué)資料和臨床資料分別以病理報(bào)告和病歷為準(zhǔn)。270名在本院進(jìn)行常規(guī)體檢的四川省漢族人被招募為對(duì)照組。病例組男性172例, 女性54例, 男性占76.11%, 女性占23.89%, 平均年齡(63.2±10.55)歲, 有78.76%吸煙, 21.24%不吸煙, 平均每年吸煙(41.2±10.18)包；對(duì)照組男性212例, 女性58例, 男性占78.52%, 女性占21.48%, 平均年齡為(61.8±11.2)歲, 吸煙有75.19%, 不吸煙24.81%, 平均每年抽煙( 38±11.21)包。對(duì)照組中的被試者無腫瘤病史及其他慢性病史(慢性阻塞性肺病、糖尿病、血液病, 自身免疫性疾病等)。對(duì)照組進(jìn)行超聲檢查, 前列腺特異性抗原、尿常規(guī)、尿沉渣鏡檢以及尿細(xì)胞學(xué)檢查以排除泌尿系統(tǒng)腫瘤。兩組一般情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 基因分型方法 采集研究對(duì)象外周血1 ml, 置入乙二胺四乙酸真空采血管內(nèi)抗凝保存?；蚪MDNA采用酚-氯仿法提取, 于-20℃保存?zhèn)溆??；诠矓?shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP; http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/and http: //www.hapmap.org/), 根據(jù)其位置、等位基因頻率以及與疾病相關(guān)度, 三個(gè)與IL-23R相關(guān)的SNP被選出。這三個(gè)SNP都是標(biāo)簽SNP, 且是常見等位基因變異。其與其他疾病的顯著相關(guān)性已被報(bào)道(包括炎癥性腸病[13]、Graves眼病[6], 胃癌[9], 卵巢癌[12])。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)被用于確定IL-23R基因型。PCR在50 ml反應(yīng)體系中進(jìn)行, 其中含5 ml 10×PCR緩沖液, 1.5mM MgCl2, 0.25mMdntps, 0.5mM引物, 100ng基因組DNA和1.5U Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增設(shè)備使用Mastercycler gradient thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Germany)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)產(chǎn)物分別進(jìn)行過夜酶切、聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸銀染色及分析。最后再隨機(jī)選取15%樣本重復(fù)測(cè)量, 兩次結(jié)果完全一致, 引物序列、反應(yīng)條件以及限制性內(nèi)切酶, 見表1。

表1 IL-23R基因的三個(gè)SNP基因分型的引物序列和反應(yīng)條件Table 1 Primer sequences and reaction conditions of IL-23R

注: Ta退火溫度ahttp: //www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。病例組與對(duì)照組之間的年齡、性別及吸煙習(xí)慣之間的差異運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。使用卡方檢驗(yàn)驗(yàn)證兩組每個(gè)序列變異符合哈迪-溫伯格平衡定律。運(yùn)用比值比(OR)和其可信區(qū)間(95% CI)來評(píng)估等位基因和基因型分布的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

基因多態(tài)與膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性分析 使用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)這三個(gè)SNP的基因型數(shù)據(jù), 結(jié)果符合已被驗(yàn)證的人群數(shù)據(jù)。在病例組與對(duì)照組的比較中, rs10889677基因型和等位基因頻率有顯著差異(P<0.05), 其C等位基因的基因頻率在病例組中明顯增加(0.2898 vs 0.1833, OR 1.818, 95%CI 1.349-2.449)(P<0.05)。rs11465817及rs7517847的等位基因和基因型分布在病例組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見表2。

3 討論

越來越多的證據(jù)支持這一假設(shè), 即慢性炎癥促進(jìn)癌癥的發(fā)展。相當(dāng)多的癌癥源于慢性炎癥。在全球每年120萬病例中, 超過15%的惡性腫瘤可歸因于感染[14]。在富有炎性細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、DNA損傷誘導(dǎo)因子的微環(huán)境中, 慢性刺激會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖, 這可能大大增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)[15]。促炎細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子、活性氧(ROS)和COX-2在炎癥環(huán)境的發(fā)生和發(fā)展中以復(fù)雜的方式相互作用[16]。近年來, 炎癥介質(zhì)的遺傳變異已成為影響腫瘤易感性和預(yù)后的重要因素[16]。其中一些基因多態(tài)性已被報(bào)導(dǎo)與膀胱癌相關(guān), 包括IL-4[17]、IL-6[3]、TNF-α[18]、TGF-β[19]、COX-2和NF-kB[20]。

表2 IL-23R基因多態(tài)性與膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性分析[n(×10-2)]Table 2 The correlation of bladder cancer and IL-23 gene polymorphism

注: ①P<0.05

IL-23主要由活化的樹突狀細(xì)胞和吞噬細(xì)胞分泌的[21], Schreiber等[22-24]認(rèn)為其是腫瘤免疫編輯三個(gè)階段(清除階段、均衡階段和逃逸階段)的重要因素。腫瘤免疫編輯學(xué)說闡述了免疫系統(tǒng)的宿主保護(hù)和腫瘤促進(jìn)的雙重作用。首先, 在早期的化學(xué)致癌作用中, 居主導(dǎo)地位的IL-23介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤漏檢或CD8+T細(xì)胞清除中起到重要作用。其次, IL-23可以促進(jìn)組織重組和新生血管形成, 這對(duì)惡性增殖也有著重要意義。最后, IL-23在癌癥進(jìn)展過程中的表達(dá)與臨床嚴(yán)重程度密切相關(guān), 提示其可能參與腫瘤免疫逃逸[25]。

IL-23 p19缺陷小鼠清楚地展示了IL-23在腫瘤發(fā)生中的作用。在化學(xué)致癌動(dòng)物模型中, 這些小鼠幾乎完全抵抗內(nèi)源性腫瘤的形成[8]。這些作者也觀察到在絕大多數(shù)來自人類各種器官的癌組織中IL-23的表達(dá)顯著升高。伴隨著IL-23表達(dá)的增加, 在腫瘤組織中可以檢測(cè)到白細(xì)胞介素17(IL-17), 后者是腫瘤形成過程中重要的細(xì)胞因子, 可促進(jìn)多種模型的血管生成, 誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶, 從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[26-27]。越來越多的證據(jù)表明IL-23 / IL-17免疫通路在自身免疫性疾病、炎性疾病[28]和腫瘤發(fā)生[25]中起重要作用。

IL-23R表達(dá)在T細(xì)胞、NKT細(xì)胞及NK細(xì)胞的表面, 同時(shí), 在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中也檢測(cè)到了低水平IL-23R復(fù)合物[4]。IL-23的生物效應(yīng)僅在IL-23兩個(gè)亞基與IL-23R復(fù)合物兩個(gè)亞基結(jié)合時(shí)有效。在最近的研究中有報(bào)道IL-23R基因多態(tài)性可能與胃癌[29]及卵巢癌[12]相關(guān), 進(jìn)一步提示IL-23R在腫瘤發(fā)生中的重要作用。

在本研究中, 我們觀察到IL-23R基因里rs10889677 A / C的基因多態(tài)性可能與膀胱癌密切相關(guān)。C等位基因的頻率較高的病例似乎更容易患膀胱癌。rs10889677多態(tài)性可能導(dǎo)致受體的過度表達(dá), 促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th17細(xì)胞亞群分化, 從而增加后者對(duì)IL-17的釋放, 進(jìn)而導(dǎo)致其它細(xì)胞因子的釋放, 引起慢性炎癥和癌癥[6, 30]。全基因組研究發(fā)現(xiàn)rs10889677與口腔癌[10]、乳腺癌[11]及卵巢癌顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明: rs10889677基因多態(tài)性可能影響IL-23信號(hào)通路的調(diào)控, 從而影響某些疾病的易感性。然而, IL-23R基因多態(tài)性與IL-23R基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

據(jù)我們所知, 本次研究的結(jié)果首次顯示了IL-23R基因多態(tài)性與膀胱癌之間的相關(guān)性。然而, 在解釋這項(xiàng)研究的結(jié)果時(shí), 也要清楚本研究中沒有顧及的其他的變異性也可能與膀胱癌相關(guān)。所以IL-23R的其他基因變異及其作用在患膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)的作用的研究是有必要的。最后, 由于基因多態(tài)性在不同種族之間有不同程度的差異, 因此需要更多的研究來闡明IL-23R基因多態(tài)性在不同種族人群中與膀胱癌的相關(guān)性。

4 結(jié)論

本文資料顯示, IL-23R基因里rs10889677 A/C的基因多態(tài)性可能與膀胱癌密切相關(guān), 其與IL-23R基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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