長春西汀注射液中的基因毒性雜質(zhì)研究與含量測定

陳雪江 郭麗蓉 沈紅婭 劉 勇 楊 志

長春西汀注射液是由主藥長春西汀和輔料山梨醇、苯甲醇、維生素C、焦亞硫酸鈉、酒石酸加水制成的無菌注射液，臨床主要用于改善腦梗死后遺癥、腦出血后遺癥、腦動脈硬化癥等誘發(fā)的各種癥狀[1-4]?；蚨拘噪s質(zhì)是指能夠直接或間接損傷細胞DNA，產(chǎn)生基因突變或體內(nèi)誘變，具有致癌可能或傾向的化合物。根據(jù)國際人用藥物注冊技術要求協(xié)調(diào)會（ICH）和歐洲藥品質(zhì)量管理局（EMA）的調(diào)查研究表明，醛類化合物均被列為潛在的基因毒性雜質(zhì)[5-6]。而根據(jù)本實驗研究表明，長春西汀注射液中含有微量的苯甲醛和糠醛，分別來自其輔料維生素C的降解和輔料苯甲醇的氧化后生成，該藥物中苯甲醛和糠醛含量的多少對臨床用藥的安全性起著至關重要的作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），Agilent 1260二極管陣列檢測器，Waters XSELECT CSH C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），LC Open lab色譜數(shù)據(jù)工作站。

1.2 試藥長春西汀注射液（自制，批號：ZEA1601、ZEA1602、ZEA1603）；長春西汀注射液（河南潤弘制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：1206211）；長春西汀注射液（原研廠家進口產(chǎn)品，匈牙利吉瑞大藥廠生產(chǎn)，批號：A46071A、A44024A、A3B023A）。苯甲醛對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，批號：111650-201303）；糠醛對照品（西格瑪試劑公司提供，批號：SHBF0159V）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[7-10]以0.2 mol/L乙酸銨溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，洗脫梯度見表1。檢測波長 280 nm；進樣 10 μl；柱溫 25 ℃；流速 1.0 ml/min。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 長春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的定位與分析取苯甲醛對照品、糠醛對照品適量，加流動相稀釋至約10 μg/ml的溶液；另取長春西汀注射液2.0 ml，置10 ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度。進樣10 μl，記錄色譜圖。通過與對照品保留時間的比對，結(jié)果表明長春西汀注射液中含有基因毒性雜質(zhì)糠醛和苯甲醛，保留時間分別為4.21 min和7.79 min。見圖1。

圖1 長春西汀注射液中的苯甲醛和糠醛定位分析

2.3 長春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的來源分析由于長春西汀注射液處方中含有輔料苯甲醇和維生素C，苯甲醇在生產(chǎn)或貯藏過程中會緩慢氧化而生成少量的雜質(zhì)苯甲醛，而維生素 C在水溶液狀態(tài)下也會緩慢降解生成雜質(zhì)糠醛，故長春西汀注射液中的基因毒性雜質(zhì)苯甲醛和糠醛主要來源于輔料苯甲醇和維生素C的氧化、降解產(chǎn)生（圖2）。

圖2 苯甲醛、糠醛的來源分析

2.4 長春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的校正因子測定長春西汀注射液的質(zhì)量標準[10]中未將苯甲醛、糠醛列為特定雜質(zhì)進行控制，該質(zhì)量標準中有關物質(zhì)檢查僅列出了由原料藥引入的 4個已知雜質(zhì)，其余未知雜質(zhì)均通過主成分自身對照法進行粗略的限度控制。

精密稱取長春西汀對照品適量，加流動相溶解并定量稀釋制成 10 μg/ml、2 μg/ml、0.4 μg/ml三個濃度梯度的標準溶液。另精密稱取苯甲醛對照品和糠醛對照品，同法稀釋制備 10 μg/ml、2 μg/ml、0.4 μg/ml三個濃度梯度的標準溶液。取上述標準溶液各進樣10 μl，記錄色譜圖，計算苯甲醛、糠醛與長春西汀的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 苯甲醛、糠醛校正因子測定結(jié)果

在同一色譜條件下，苯甲醛、糠醛與長春西汀的相對校正因子均超出 0.9～1.1的范圍內(nèi)，采用峰面積歸一化法或主成分自身對照法計算其含量時，會由于色譜響應值的差異產(chǎn)生較大誤差，故長春西汀注射液中的苯甲醛和糠醛含量測定不宜采用質(zhì)量標準中規(guī)定的主成分自身對照法，而應采用外標法或乘以校正因子進行其含量計算。

2.5 長春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的含量測定取苯甲醛對照品、糠醛對照品適量，加流動相稀釋至約1.0 μg/ml的溶液，作為對照品溶液；另取長春西汀注射液2.0 ml，置10 ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，作為供試品溶液。進樣10 μl，按外標法計算不同廠家生產(chǎn)的長春西汀注射液中苯甲醛和糠醛的含量，結(jié)果見表3。

表3 苯甲醛、糠醛的含量測定結(jié)果

結(jié)果顯示，不同廠家生產(chǎn)的長春西汀注射液中均檢出含有毒性雜質(zhì)苯甲醛和糠醛，其含量略有差異，苯甲醛含量在0.03%～0.07%之間，糠醛含量在0.006%～0.05%之間。

2.6 長春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的限度及安全性評價目前，藥品中的基因毒性雜質(zhì)一般采用每日允許最大暴露量（PDE）和毒性物質(zhì)限量（TTC）來進行雜質(zhì)的限量控制。查閱 CPDB（The Carcinogenic Potency Database）數(shù)據(jù)庫，苯甲醛和糠醛的半數(shù)中毒劑量（TD50）結(jié)果詳見表4。

表4 苯甲醛、糠醛毒性數(shù)據(jù)

根據(jù)苯甲醛和糠醛的TD50數(shù)據(jù)，采用線性外推法，計算出苯甲醛和糠醛的毒性物質(zhì)限量（TTC）分別為1490 μg/d和197 μg/d；根據(jù)長春西汀注射液中苯甲醛和糠醛的含量測定結(jié)果，推算出本品中苯甲醛和糠醛含量均處于安全限度范圍內(nèi)，結(jié)果見表5。

根據(jù)TTC推算出長春西汀注射液中苯甲醛和糠醛的理論雜質(zhì)限度為4.97%和0.66%，結(jié)合本品中糠醛、苯甲醛實際測定結(jié)果，不同廠家生產(chǎn)的長春西汀注射液中苯甲醛和糠醛的含量遠低于二者的理論雜質(zhì)限度，故可認為長春西汀注射液中苯甲醛和糠醛含量處于安全限度范圍內(nèi)。

表5 苯甲醛、糠醛安全性分析

2.7 長春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的穩(wěn)定性考察酸破壞：精密量取長春西汀注射液2.0 ml，加1 mol/L鹽酸溶液2 ml，室溫放置24 h后取樣測定雜質(zhì)變化情況。堿破壞：精密量取長春西汀注射液2.0 ml，加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml，室溫放置4 h后取樣測定雜質(zhì)變化情況。高溫破壞：精密量取長春西汀注射液2.0 ml，于100 ℃的恒溫干燥箱中放置24 h后取樣測定雜質(zhì)變化情況。氧化破壞：精密量取長春西汀注射液2.0 ml，加入5%雙氧水溶液4 ml，室溫放置4 h后取樣測定雜質(zhì)變化情況。

結(jié)果顯示，長春西汀注射液經(jīng)酸、堿、氧化、高溫破壞后，其雜質(zhì)種類和數(shù)量均有不同程度的增加。經(jīng)酸、堿破壞后，長春西汀注射液中的苯甲醛和糠醛含量無顯著變化；經(jīng)高溫破壞24 h后，長春西汀注射液中的苯甲醛峰面積由2.5增加到16.5，其含量增加了6倍；糠醛峰面積由5.3增加到27.5，其含量增加了5倍。經(jīng)5%雙氧水破壞4 h后，長春西汀注射液中的苯甲醛峰面積由2.5增加到56.2，其含量增加了22倍。結(jié)果表明，長春西汀注射液中的苯甲醛和糠醛含量不穩(wěn)定，在高溫和氧化劑存在的條件下，苯甲醛和糠醛含量會顯著增加。

3 討論

不同廠家生產(chǎn)的長春西汀注射液中均含有微量的苯甲醛和糠醛，分別來自其輔料維生素C的降解和輔料苯甲醇的氧化后生成，苯甲醛含量在0.03%～0.07%之間，糠醛含量在0.006%～0.05%之間，含量均處于安全限度范圍之內(nèi)。

經(jīng)長春西汀注射液穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，長春西汀注射液對酸、堿、氧和高溫均較為敏感，在100 ℃條件下放置24 h后，糠醛含量增加了5倍，苯甲醛含量也增加了 6倍；在有氧氧化劑存在的條件下，樣品放置24 h，其苯甲醛含量增加了22倍。因此，要求長春西汀注射液在貯藏過程中應避免高溫、陽光直射，在臨床使用過程中應盡量避免藥物與空氣的長時間接觸。

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