mad2檢測作為小細胞肺癌早期診斷潛在指標的臨床研究*

吳洋 譚立明 陳娟娟 李華 應(yīng)后群 蔣永清 吳瓊 于國芳 田永建 余建林 曾婷婷顏玲仙 劉川

肺癌（lung cancer，LC）是導致全世界癌癥相關(guān)死亡的首要原因［1］。小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）在所有LC中占14%左右［2］。目前SCLC的發(fā)病機制尚不明確。SCLC分化極差、侵襲性強、生長迅速，常發(fā)展到晚期才出現(xiàn)明顯臨床表現(xiàn)，故早診斷、早治療是關(guān)鍵。目前SCLC診斷主要依靠病理學檢查，屬于有創(chuàng)性檢查。因此亟需無創(chuàng)性指標用于早期SCLC的診斷。NSE（neuron specific enolase）是目前臨床診斷SCLC最常用的指標，但是由于NSE敏感度不高，所以需其他指標用來聯(lián)合診斷SCLC。研究表明大部分腫瘤細胞都呈非整倍體，稱之為染色體不穩(wěn)定（chromosome instability，CIN）［2］。在細胞有絲分裂過程中，有絲分裂紡錘體檢測點（spindle assemble checkpoint，SAC）的功能異常導致染色體在高等真核生物細胞中錯誤分離，進而直接導致CIN的發(fā)生。SAC主要由Mad2，Bub1和Bub2組成［4-6］。mad2基因是調(diào)控Mad2蛋白表達的基因，在SAC監(jiān)測有絲分裂過程中染色體著絲粒與微管結(jié)合過程中起著重要的調(diào)控作用。但關(guān)于mad2在小細胞肺癌中的表達尚無相關(guān)研究報道。本研究利用qt-PCR檢測SCLC中mad2的表達，聯(lián)合抗紡錘體抗體（anti-nuclear mitotic spindle apparatus antibody，MSA）及抗著絲點抗體（anticentromere antibody，ACA），探討其在SCLC診斷中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 患者一般特征

納入的患者均來自南昌大學第二附屬醫(yī)院自2011年12月至2016年12月門診及住院的患者，患者一般特征見表1。其中120例SCLC患者（男性89例，女性31例，年齡26～86歲，平均62歲，吸煙病史63例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例），110例非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者（男性65例，女性45例，年齡35～84歲，平均64歲，吸煙病史53例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例），115例肺結(jié)節(jié)（pulmonary nodule，PN）患者（男性61例，女性54例，年齡32～87歲，平均59歲，吸煙病史55例）。

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計 本研究為前瞻性、隨機對照臨床試驗，旨在評價mad2檢測在早期診斷SCLC的臨床價值。本研究通過南昌大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準許可。

1.2.2 入組和排除標準 SCLC診斷標準參考美國NCCN小細胞肺癌臨床實踐指南［7］；NSCLC診斷標準參考美國NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南［8］；PN診斷標準參考美國胸科醫(yī)師學會（ACCP）制定的PN評估指南［9］。

入組標準：1）知情、自愿參與；2）診斷明確，臨床、影像學、病理組織學資料完整；3）對入選患者的資料重新評估，否定合并其他自身免疫性疾病及合并其他癌癥；4）健康對照組者血常規(guī)、血壓、血糖、血脂、胸片、心電圖及肝膽胰檢查無異常。

排除標準：1）腫瘤分型不明確或非原發(fā)性腫瘤；2）合并嚴重心、肺、肝臟等系統(tǒng)疾病，甲狀腺疾病、糖尿??；3）妊娠或哺乳期婦女；4）不符合納入標準者。

1.2.3 標本的采集 1）mad2 mRNA的檢測標本采用EDTA抗凝管采集空腹狀態(tài)下的靜脈血2.0 mL，利用RNA Trizol試劑盒提取RNA，-80℃凍存，避免反復凍融。2）NSE，MSA及ACA的檢測標本采用空腹采靜脈不抗凝血3.0 mL左右，1 028×g離心15 min分離血清，-80℃凍存，避免反復凍融。

1.2.4 熒光定量PCR（qt-PCR） 1）利用RNA Trizol試劑盒（采購自大連寶生物有限公司）提取總RNA。mad2 mRNA的長度為163 bp，GAPDH作為內(nèi)參。DNA Ladder長度為1 kb。利用熒光定量試劑盒按以下步驟擴增mad2 mRNA特異性序列。2）引物序列：mad2 mRNA上游引物序列：5'-AGCTCCTTTTGACCTTCATTTC-3'；下游引物序列：5'-TCCATTGCTTCATAGGTTCAAG-3'；GAPDH上游引物序列：5'-ACGGTGACATTTCTGCCACT-3'；下游引物序列5'-TGGTCCCGACTCTTCCCATT-3'。反應(yīng)體系：2×Master Mix（Roche）5.0 μL，上游引物序列0.3 μL，下游引物序列0.3 μL，加dd H2O至總體積為9 μL。擴增步驟：95℃預(yù)熱5 min，95℃變性持續(xù)30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復35個循環(huán)，最后在72℃下最終延伸7 min。收集產(chǎn)物行熒光定量檢測。

1.2.5 NSE檢測 NSE運用電化學發(fā)光方法檢測，試劑盒（購自上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）的cutoff值為17.0 ng/mL。

1.2.6 間接免疫熒光法檢測MSA和ACA抗體 試劑由德國歐蒙實驗診斷有限公司生產(chǎn)，MSA抗體采用提供的全新Hep-20-10細胞株，ACA采用Hep-2細胞，4℃保存?zhèn)溆谩吮景丛噭┮笙♂專?:100稀釋），取25 μL于玻片上，覆上生物膜片，室溫孵育30 min，洗去游離標本，用洗液浸泡5 min，瀝干加20 μL異硫氰酸熒光素標記二抗，避光室溫孵育30 min，洗去游離二抗，用洗液浸泡5 min，瀝干后封片。熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學分析采用SPSS 23.0軟件。利用EpiCalc 2000計算實驗樣本量。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）描述。mad2檢測數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，采用Wilcoxon秩和檢驗；MSA和ACA數(shù)據(jù)采用χ2檢驗；一致性分析計算Kappa值；對計量資料作受試者特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），計算ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床特征

120例SCLC、110例NSCLC、115例PN患者納入研究。3組患者在年齡、性別、吸煙史上均無差異，SCLC與PN組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無差異。NSE在SCLC與NSCLC組中表達明顯高于PN組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NSE在SCLC組與NSCLC組中差異均無統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表1。

表1 患者臨床特征

2.2 mad2表達情況

mad2在SCLC組及NSCLC組中均有表達，PN組中無表達，結(jié)果見圖1；在qt-PCR定量表達分析中，與NSCLC組相比，mad2在SCLC組中表達量更高（P＜0.05），結(jié)果見圖2。

圖1 mad2表達瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 mad2診斷SCLC的ROC曲線

mad2診斷SCLC的ROC曲線下AUC是0.799，95%置信區(qū)間（1.297、1.314），診斷敏感性53.32%，特異性88.73%，結(jié)果見圖3。

圖2 mad2熒光定量表達圖

圖3 mad2診斷SCLC的ROC曲線

2.4 mad2聯(lián)合NSE診斷SCLC

NSE診斷SCLC的敏感性為33.02%，特異性為93.01%，約登指數(shù)為0.26；mad2聯(lián)合NSE診斷SCLC的敏感性為63.23%，特異性為85.31%，約登指數(shù)為0.49，結(jié)果見表2。

表2 mad2聯(lián)合NSE診斷SCLC

2.5 MSA和ACA的表達情況

2.5.1 MSA、ACA與SCLC相關(guān)性分析 MSA與ACA的IIF圖形（圖4，5），MSA和ACA與SCLC有較強的相關(guān)性，OR值分別為6.94和5.60，見表3。

2.5.2 MSA及ACA診斷SCLC的臨床價值評價 診斷SCLC的敏感性及特異性最高的為MSA，敏感性35.00%，特異性96.00%，陽性預(yù)測值0.79，陰性預(yù)測值0.73，陽性似然比8.75，約登指數(shù)0.31，見表4。

2.6 mad2聯(lián)合MSA和ACA串并聯(lián)分析

2.6.1 mad2聯(lián)合MSA及ACA一致性分析 mad2聯(lián)合MSA診斷SCLC的Kappa值0.486（P＜0.01），mad2聯(lián)合ACA診斷SCLC的Kappa值0.421（P＜0.01），mad2與MSA及ACA一致性中等，所以mad2可以聯(lián)合MSA與ACA診斷SCLC，見表5。

2.6.2 mad2檢測聯(lián)合MSA和ACA診斷串并聯(lián)分析mad2檢測聯(lián)合MSA和ACA并聯(lián)分析診斷SCLC的敏感性83.31%，特異性79.34%，約登指數(shù)0.62，串聯(lián)分析診斷SCLC的敏感性65.32%，特異性93.35%，約登指數(shù)0.59，見表6。

圖4MSA核型

圖5ACA核型

表3 MSA及ACA與SCLC相關(guān)性分析

表4 MSA及ACA診斷SCLC的臨床價值評價

表5 mad2聯(lián)合MSA及ACA一致性分析

表6 mad2聯(lián)合MSA及ACA診斷串并聯(lián)分析

3 討論

腫瘤的發(fā)生與CIN密切相關(guān)。有絲分裂過程中姐妹染色體的異常分裂常常導致非整倍體的形成，導致CIN的發(fā)生［10-12］。在細胞有絲分裂過程中，SAC在調(diào)控染色體分裂中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在有絲分裂后期，SAC調(diào)控染色體與著絲點及微管附著，一旦形成異常的染色體，SAC會立即阻止染色體與著絲點及微管附著［13］。調(diào)節(jié)Mad2蛋白表達的mad2異常導致SAC功能受到抑制，進而激活A(yù)PC/C。APC/C通過解除SAC對染色體的監(jiān)控使得異常的染色體進入有絲分裂后期導致非整倍體細胞的形成，導致腫瘤發(fā)生［14］。因此，在腫瘤發(fā)生的早期即可檢測到mad2異常表達。mad2是高度保守的基因，極少發(fā)生突變。但是mad2在各種腫瘤中表達量各異，在NSCLC中該基因過度表達［15］，而在胃癌和卵巢癌中表達降低［5，16］，機制暫不明確。目前暫無mad2在SCLC中表達的相關(guān)研究報道，可能與SCLC研究熱度不高有關(guān)。本研究首次通過qt-PCR檢測mad2在SCLC中的表達情況。

PN是肺癌發(fā)生的前哨。本研究通過qt-PCR發(fā)現(xiàn)mad2在NSCLC組中表達上調(diào)，與PN組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這與齊魯?shù)难芯繄蟮老喾?7］；mad2在SCLC組中過度表達，與肺結(jié)節(jié)組相比差異也有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示mad2在SCLC發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，這與mad2過度表達導致SAC功能受到抑制有關(guān)，具體機制尚待進一步研究；有趣的是mad2在NSCLC組與SCLC組表達量有差異（P＜0.05），mad2表達量在SCLC組顯著高于NSCLC。根據(jù)mad2表達量的差異可用于早期鑒別診斷SCLC，NSCLC和PN。當mad2表達量95%置信區(qū)間（1.297、1.314）時診斷SCLC的ROC曲線下AUC面積為0.799，特異性88.73%，診斷價值中等，故mad2有作為SCLC診斷指標的潛能。但mad2診斷SCLC的敏感性53.32%，敏感性不高，故應(yīng)聯(lián)合其他生物學指標。NSE是目前臨床上SCLC常用標志物，本研究發(fā)現(xiàn)NSE診斷SCLC的敏感性為33.02%，特異性為93.01%，聯(lián)合mad2后敏感性為63.23%，敏感性顯著提高，mad2聯(lián)合NSE診斷SCLC在臨床上是個理想的選擇。劉冬青發(fā)現(xiàn)LC與ACA關(guān)系密切，但是缺乏ACA在LC診斷中的研究［18］。Giladi等［19］通過基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)紡錘體的異常導致CIN發(fā)生，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究在前期工作中發(fā)現(xiàn)SCLC與MSA和ACA的有絲分裂相關(guān)的抗體密切相關(guān)［20］，與報道相符。本研究發(fā)現(xiàn)SCLC與MSA及ACA相關(guān)性較好，OR值分別為6.94、5.60；且MSA及ACA在診斷SCLC上具有很強的臨床價值，特異性分別為96.00%和92.89%，陽性預(yù)測值分別為0.79和0.69，陰性預(yù)測值分別為0.73和0.71，陽性似然比分別為8.75和4.21，陰性似然比分別為0.68和0.75，約登指數(shù)分別為0.32和0.22，故MSA及ACA可以作為診斷SCLC的理想指標。但MSA及ACA診斷SCLC的敏感性低，分別為35.00%和30.00%，因此聯(lián)合mad2檢測、MSA和ACA檢測行串并聯(lián)分析非常必要。mad2檢測在診斷SCLC方面與MSA及ACA相關(guān)性較好，Kappa值分別為0.49和0.42。通過計算發(fā)現(xiàn)，mad2檢測串聯(lián)MSA和ACA檢測能夠明顯提高mad2檢測診斷SCLC的敏感性，其敏感性達到83.31%，顯著高于任何單一指標的敏感性；并聯(lián)分析能顯著提高其特異性，特異性達到93.35%。因此通過聯(lián)合mad2檢測、MSA和ACA檢測來診斷SCLC是一種理想方案。

綜上所述，聯(lián)合檢測mad2，MSA和ACA可用于SCLC與NSCLC及PN的早期鑒別診斷，為臨床診斷SCLC提供一種新方案。

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