microRNA對體細(xì)胞重編程為神經(jīng)細(xì)胞的研究進(jìn)展

許婷婷 ，王躍嗣

（1.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東 青州 262500；2.濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，山東 煙臺 264003）

隨著社會老齡化進(jìn)程的加劇，各種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病人數(shù)也逐年增加。神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)損傷（如腦缺血、腦中風(fēng)、脊髓損傷等）嚴(yán)重威脅著人類的身體健康。帕金森病、阿爾茨海默病、腦中風(fēng)等均是由于分化成熟的神經(jīng)細(xì)胞受到損傷不能分裂增殖以彌補(bǔ)損傷或死亡細(xì)胞所造成的，因此尋找新的神經(jīng)元細(xì)胞對治療神經(jīng)退行性疾病具有重要意義。雖然胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cell，ESC）、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（induced Pluripotent Stem Ccell，iPSC）能夠在體外分化形成神經(jīng)細(xì)胞，但其應(yīng)用于臨床前受到分化效率低、易形成腫瘤危害等限制。自2006年Takahashi等[1]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞重編程技術(shù)以來，細(xì)胞重編程技術(shù)越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的青睞。將體細(xì)胞作為靶細(xì)胞，重編程形成神經(jīng)細(xì)胞，使治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為可能。

1 細(xì)胞重編程

把體細(xì)胞重編程為iPSC是一項(xiàng)具有革命性的技術(shù)[2]。2006年 Takahashi和 Yamanaka[1]第一次把 Oct4、Sox2、Klf和 c-Myc 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染方式在小鼠成纖維細(xì)胞上過表達(dá)形成iPSC，這些細(xì)胞與小鼠ESC具有相似的生長特性和形態(tài)。因?yàn)閏-Myc是原癌基因，形成的iPSC具有癌變可能，自從iPSC產(chǎn)生以來就存在癌變的潛在危險(xiǎn)，如果無法解決癌變可能，iPSC就無法在臨床上應(yīng)用。因此，研究人員開展了多種替代研究，企圖實(shí)現(xiàn)同時(shí)具有iPSC功能，又不具有癌變潛能的新的重編程分子。后來研究人員又整合了包括Nanog、Esrrb、Nr5a2等多種不同基因重編程為成纖維細(xì)胞和其他不同類型的體細(xì)胞，但是Oct4卻不能被其他因子所替代，這表明在細(xì)胞重編程中它起到特定的作用。

2 miRNA參與細(xì)胞重編程

為提高細(xì)胞重編程的效率，研究人員試用了各種不同的小分子和特定的miRNA。在細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)染Oct4、Klf4和Sox2（OKS）的同時(shí)，想用miRNA替代c-Myc，結(jié)果發(fā)現(xiàn)[3]，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-291-3p、miR-294或miR-295可以形成iPSC，且能增加iPSC形成數(shù)目。跟c-Myc不同，在去分化的早期階段，miR-294不會誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞增殖，與外源性的c-Myc相比，miR-294能產(chǎn)生同源的iPSC克隆。

目前已有研究表明[4-5]，只用miRNA就可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮多能性。在沒有轉(zhuǎn)錄因子的情況下，只用逆轉(zhuǎn)錄病毒過表達(dá)miR-302/367能誘導(dǎo)小鼠和人的成纖維細(xì)胞形成iPSCs[4]，這些細(xì)胞注入囊胚后可形成畸胎瘤，并且過度表達(dá)miR-302/367能加速細(xì)胞重編程，提高編程效率，但在不表達(dá)miR-367的條件下，培養(yǎng)3周后仍然沒有獲得iPSCs的克隆，這就暗示miR-302/367介導(dǎo)的重編程中需要有miR-367的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[5]，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-200c、miR-302和miR-367這一組合可以重編程小鼠和人的體細(xì)胞。盡管到目前為止，miRNA介導(dǎo)的重編程還沒被廣泛用于實(shí)驗(yàn)，但是研究人員已經(jīng)開始重視miRNA的作用。用經(jīng)典的四因子重編程小鼠成纖維細(xì)胞時(shí)，加入miR-302家族和miR-290家族能輕微提高細(xì)胞重編程效率，但在沒有其他轉(zhuǎn)錄因子的情況下，這兩個(gè)家族的miRNA不能完成誘導(dǎo)。

另一研究[6]表明了miRNA在細(xì)胞重編程中的重要作用，成纖維細(xì)胞在缺失所有成熟miRNA的情況下不能形成iPSCs。因此，miRNA不僅在多能細(xì)胞的分化中是必須的，還在纖維細(xì)胞的去分化過程中起著重要作用。

在細(xì)胞重編程的最初階段，許多miRNA家族被認(rèn)定為上皮-間充質(zhì)之間轉(zhuǎn)化（MET）的介質(zhì)，而MET存在于體細(xì)胞重編程的起始階段。其中，研究較詳細(xì)的是miR-205和miR-200家族，它們都是由BMP誘導(dǎo)而成，并且參與維持細(xì)胞的多能性。miR-200家族可以通過抑制E-cadherin的抑制因子Zeb1和Zeb2，還有Snail和Slug來促進(jìn)MET[7]。除了miR-200家族，還有許多其他的miRNA家族能夠提高細(xì)胞重編程效率。表達(dá)分析在mESCs重編程起始階段中高表達(dá)的miRNA家族，顯示在重編程的前 4 天，miR-17/92、miR-106b/25、miR-106a/363 和miR-302b/367會有表達(dá)[8]。通過促進(jìn)MET，miR-106b/25家族能增強(qiáng)iPSC的誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)染miR-93和miR-106b可以增加iPSCs克隆的數(shù)目，而抑制這兩種miRNA可以減少克隆的數(shù)目。在人成纖維細(xì)胞重編程過程中，轉(zhuǎn)染OSKC的第二天和第七天轉(zhuǎn)染miR-302b和miR-372可以增加克隆的數(shù)目[9]。miR-302b、miR-372和miR-294具有相同的種子序列，能夠阻止在人類永生化表皮細(xì)胞中TGF-β誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)之間的轉(zhuǎn)化（ETM）。并且，經(jīng)過改良的具有突變種子序列的miR-294不能抑制TGF-β誘導(dǎo)ETM，這就表明了種子序列在這些miRNAs中的重要性。

miR-21和miR-29a可以干擾iPSC的形成[10]，這兩種miRNA都在小鼠成纖維細(xì)胞中大量表達(dá)，缺失這兩種miRNA可以通過調(diào)節(jié)p53和ERK1/2通路來提高重編程效率。所有的研究都表明，miRNA不僅在維持未分化細(xì)胞的狀態(tài)中起作用，也能影響已分化細(xì)胞的命運(yùn)。

3 miRNA對神經(jīng)系統(tǒng)的作用和重編程誘導(dǎo)作用

3.1 miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)

miRNA在神經(jīng)發(fā)育過程中的神經(jīng)元、神經(jīng)祖細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有特定表達(dá)。近年來，miRNA在干細(xì)胞及其分化中的作用開始受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA，如miR-29和miR-126主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)；而miR-138、miR-124主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，部分miRNA的表達(dá)具有短暫性和區(qū)域性[11]。部分miRNA的表達(dá)模式與其發(fā)育階段存在一定關(guān)聯(lián)。miR-126可以負(fù)調(diào)控神經(jīng)管發(fā)育中血管內(nèi)皮生長因子A的表達(dá)，從而對神經(jīng)系統(tǒng)血管網(wǎng)絡(luò)的形成起間接的調(diào)控作用[12]，也有協(xié)同調(diào)節(jié)神經(jīng)管發(fā)育過程中類胰島素生長因子、Shh通路和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白通路的作用[13]。

在腦組織中表達(dá)最豐富的一類miRNA—miR-124，主要在已分化成熟的神經(jīng)元中表達(dá)。若將miR-124轉(zhuǎn)染到多種細(xì)胞中，可以抑制一系列非神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，并且誘導(dǎo)這些細(xì)胞基因組向神經(jīng)方向轉(zhuǎn)化[14]。研究發(fā)現(xiàn)[15]，成纖維細(xì)胞可以在miR-124的參與下重編程，誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞。在功能上，miRNA可以通過引發(fā)靶mRNA的降解和翻譯抑制來介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因的沉默，參與蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)，在神經(jīng)系統(tǒng)分化、發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[16]。有研究顯示[17]，miR-124-9-9*不僅能夠使成纖維細(xì)胞重編程為神經(jīng)細(xì)胞，而且還可以提高米勒神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞編程為視網(wǎng)膜神經(jīng)元的概率。在已知的miRNA中，大約70%在哺乳動物大腦中有表達(dá)。很多miRNA參與了神經(jīng)系統(tǒng)不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因表達(dá)調(diào)控且有不同的生理過程，比如神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生和發(fā)育、神經(jīng)干細(xì)胞的分化、樹突棘形成、神經(jīng)保護(hù)等[16]。有一些miRNA可以參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的分化和命運(yùn)[18]。miRNA參與了很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程，如帕金森病、腦腫瘤、精神分裂癥等引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[19-20]。

3.2 miRNA參與細(xì)胞重編程為神經(jīng)細(xì)胞

3.2.1 miRNA參與重編程為神經(jīng)前體細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞2011年3月，Janghwan Kim等[21]把小鼠成纖維細(xì)胞重編程為神經(jīng)前體細(xì)胞，他們以病毒為載體將Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞中，將這些細(xì)胞誘導(dǎo)分化為Pax+、Sox1+、Sox17+、T+的神經(jīng)前體細(xì)胞（Neural stem/Progenitor Cells，NPCs）。2011年12月，Ernesto Lujan等[22]將小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為NPCs，基因嵌入Sox2-IRES-EGFP的小鼠中原代培養(yǎng)獲得MEF，再將11種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)24天后，檢測誘導(dǎo)形成的細(xì)胞為NPCs。 2012年2月，Dong Wook Han等[23]通過指定的轉(zhuǎn)錄因子將成纖維細(xì)胞重編程為神經(jīng)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中，他們將相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞而獲得iNSCs，此類細(xì)胞表現(xiàn)出的細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)的表觀遺傳特征、分化電位和自我更新能力與野生型的神經(jīng)干細(xì)胞相似。2012年3月，Marc Their等[24]將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化穩(wěn)定增殖的神經(jīng)干細(xì)胞，通過組成性誘導(dǎo)Sox2、Klf4、c-Myc，同時(shí)在重編程的初始階段嚴(yán)格限制Oct4的活性，分化形成了可以傳代＞50代的神經(jīng)干細(xì)胞iNSCs，iNSCs有巢蛋白、Pax6、Olig2的表達(dá)，此外，還可以分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。又有研究者用單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct4重編程人的血細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)祖細(xì)胞。在細(xì)胞重編程形成神經(jīng)細(xì)胞的過程中，體細(xì)胞往往先形成多潛能干細(xì)胞再分化為神經(jīng)細(xì)胞，但這一重編程效率很低，并且多數(shù)不能傳代生長，還由于缺少再活化的重編程因子，多潛能干細(xì)胞往往可能會形成畸胎瘤，用于臨床治療，我們必須考慮形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)和細(xì)胞在體外可自我再生。miRNA在iNSC重編程中的作用可以借鑒對iPSC的研究，有實(shí)驗(yàn)顯示，小鼠和人的iPSC可以通過miRNA的組合和轉(zhuǎn)錄因子的重編程形成。組合的miRNA和轉(zhuǎn)錄因子可以使人成纖維細(xì)胞完成神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并且可以往特定神經(jīng)細(xì)胞類型分化。過表達(dá)miR-146可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞分化。小鼠ESC 特異的 miRNA、miR-291-3p、miR-294、miR-295可以提高Klf4、Oct4、Sox2的誘導(dǎo)多能性，因此，可以篩選和研究NSC特異的miRNA來推動iNSC的形成。

3.2.2 miRNA參與重編程為神經(jīng)元 2011年 5月，Ulrich Pfisterer等[25]將人成纖維細(xì)胞重編程成多巴胺神經(jīng)元，通過過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Ascl1、Brn2、Myt1Ⅰ，人成纖維細(xì)胞可以高效轉(zhuǎn)化為功能型神經(jīng)元。2011年7月，《Cell》上刊登了Esther YSon等[26]的實(shí)驗(yàn)，他們將小鼠和人的成纖維細(xì)胞重編程為功能性的運(yùn)動神經(jīng)元；同時(shí)，也報(bào)道了Rajesh Ambasudhan等[27]在一定的條件下，把人成纖維細(xì)胞重編程為功能型神經(jīng)元，miR-124和兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（MYT1L、BRN2）的組合可以把中胚層人成纖維細(xì)胞重編程為外胚層功能型神經(jīng)元。研究報(bào)道[28]，在人成纖維細(xì)胞中過表達(dá)miR-302/367家族和兩種神經(jīng)元特異性的miRNA（miR-9/9*、miR-124），可將其重編程為神經(jīng)元，并且這些細(xì)胞可以在裸鼠腦中被觀測到，這推進(jìn)了細(xì)胞重編程的研究，并對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了理論支持。

3.2.3 miRNA參與重編程為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的再生過程中，許多miRNA也參與其中。miR-125b可以調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和星形膠質(zhì)細(xì)胞的再生。星形膠質(zhì)細(xì)胞在生理和病理的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用，它可以參與突觸形成、影響神經(jīng)遞質(zhì)吸收等。在大腦發(fā)育過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-29的表達(dá)比在神經(jīng)元中的表達(dá)強(qiáng)烈，并且實(shí)驗(yàn)表明[29]，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，miR-29a在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)非常強(qiáng)烈。有研究表明[30]，可以用miR-302/367再加VPA（組蛋白去乙?；敢种苿┲鼐幊倘撕褪蟮男切文z質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞來治療神經(jīng)疾病。

4 展望

近年來，細(xì)胞替代治療和基因治療為人類征服多種疾病提供了希望。miRNA作為新的研究熱點(diǎn)，在細(xì)胞重編程中越來越受到人們的重視。目前已有不少研究證實(shí)miRNA在體細(xì)胞重編程中起著重要作用，對于miRNA把體細(xì)胞重編程為神經(jīng)細(xì)胞的研究也取得了一些進(jìn)展，但在神經(jīng)細(xì)胞重編程中，miRNA的作用機(jī)制仍然需要繼續(xù)深入研究。這些研究必將加速促進(jìn)體細(xì)胞重編程為神經(jīng)細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。iNSC細(xì)胞的重編程給細(xì)胞命運(yùn)、藥物發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞移植研究提供了新的方法。隨著研究的深入，iNSC的重編程可以進(jìn)一步推動重編程的研究及探索。

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