核酸適配體在感染性疾病診治中的研究進(jìn)展

田雨，趙俊，陳敬賢，王明麗

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院, 合肥 230601； 2. 安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室, 合肥 230032

核酸適配體又稱核酸適體，或稱適配子，是一段能與靶分子特異性結(jié)合的單鏈核酸分子，可為DNA或RNA。1990年，Tuerk和Gold[1]發(fā)明了從寡核苷酸文庫(kù)中篩選與噬菌體DNA聚合酶特異性結(jié)合的RNA序列的技術(shù)，即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術(shù)。同年，Ellington等[2]利用SELEX技術(shù)篩選到了與染料分子汽巴克隆藍(lán)(cibacron blue)、活性藍(lán)4(reactive blue 4)結(jié)合的RNA序列，并將這種具有特異性結(jié)合能力的寡核苷酸序列命名為“aptamer”，即核酸適配體。

核酸適配體的形成，首先要在單鏈核酸序列的基礎(chǔ)上形成莖環(huán)、發(fā)卡或G-四鏈體等二級(jí)結(jié)構(gòu)，再通過(guò)內(nèi)部堿基配對(duì)、形成氫鍵及靜電作用等形成空間結(jié)構(gòu)。核酸適配體與靶分子的結(jié)合主要依靠非共價(jià)鍵相互作用，如范德華力、氫鍵、芳環(huán)堆積和靜電相互作用等實(shí)現(xiàn)。在與靶分子結(jié)合的特異性和親和力上，核酸適配體足以與抗體媲美，因此也有“化學(xué)抗體”的美譽(yù)。目前，核酸適配體在物質(zhì)檢測(cè)、分子成像、靶向治療和疾病診斷等生物醫(yī)學(xué)多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力。2009年北京香山科學(xué)會(huì)議上，國(guó)內(nèi)學(xué)者以“核酸適配體及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用”為主題展開(kāi)討論，與會(huì)專(zhuān)家一致認(rèn)為核酸適配體生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域方興未艾，應(yīng)抓住機(jī)遇，推動(dòng)我國(guó)在核酸適配體生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及應(yīng)用方面的研究[3]。國(guó)內(nèi)學(xué)界對(duì)核酸適配體的關(guān)注也因此進(jìn)一步提升。本文就核酸適配體在感染性疾病診治方面的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 SELEX技術(shù)和核酸適配體的特性

SELEX技術(shù)本質(zhì)上是一種在體外模擬自然進(jìn)化的定向進(jìn)化技術(shù)，其原理是先構(gòu)建寡聚核苷酸文庫(kù)，將靶分子與文庫(kù)中的眾多核酸序列一同孵育，隨后通過(guò)硝酸纖維素濾膜結(jié)合、電泳或磁性分離等方法，將與靶分子結(jié)合的序列與非結(jié)合序列分開(kāi)，再利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)(獲取DNA適配體時(shí)使用)或反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)(獲取RNA適配體時(shí)使用)擴(kuò)增與靶分子親和的核酸序列，獲得經(jīng)過(guò)富集后的“子代”核苷酸文庫(kù)。重復(fù)上述過(guò)程，經(jīng)過(guò)多輪篩選后，即可獲得能與靶分子高度親和的核酸片段，通常在獲取目標(biāo)序列后，會(huì)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，評(píng)估其與靶分子的結(jié)合能力[4-5]。SELEX技術(shù)決定了核酸適配體靶分子的廣泛性，其范圍涵蓋從金屬離子、化合物、多肽、核酸、蛋白質(zhì)到細(xì)胞的巨大區(qū)間，甚至包括了某些復(fù)雜靶標(biāo)，如病毒、細(xì)菌等病原體。而基于SELEX技術(shù)，以病原體的某些特異性或關(guān)鍵性物質(zhì)為靶標(biāo)，如表面蛋白或完成生理過(guò)程必需的關(guān)鍵酶等，獲取相應(yīng)的核酸適配體，有望用于病原體診斷或感染的治療。

在此方面，核酸適配體與抗體的功能較為類(lèi)似。但在檢測(cè)方面，對(duì)那些尚未掌握其特定標(biāo)記的病原體，還無(wú)法利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。利用SELEX技術(shù)，可將病毒、細(xì)菌等病原體為靶標(biāo)進(jìn)行篩選，獲取針對(duì)病原體上未知特異性結(jié)構(gòu)的核酸適配體，而無(wú)需事先知曉其標(biāo)記[6]。在這一點(diǎn)上，核酸適配體具有抗體無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。除在靶分子范圍方面優(yōu)于抗體，核酸適配體本身為核酸，這也賦予了它眾多優(yōu)良特性，如與蛋白質(zhì)相比，核酸性質(zhì)更加穩(wěn)定，可耐受較大范圍的酸堿度、溫度和較廣泛的有機(jī)溶劑，便于存儲(chǔ)；核酸適配體相對(duì)分子質(zhì)量較抗體更小，有良好的組織穿透能力，免疫原性較低，不易引起機(jī)體的免疫反應(yīng)；可在體外篩選，通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行大量可重復(fù)、低成本的合成，且各批次間無(wú)差異；易于修飾改造，能連接不同的基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)與各種載體的結(jié)合等。

得益于其優(yōu)良的理化特性，核酸適配體在醫(yī)學(xué)診斷和疾病治療方面具有巨大的應(yīng)用前景。在如今病原體變異和新型病原體感染高發(fā)的情況下，核酸適配體可能提供了一種良好的應(yīng)對(duì)解決策略。

2 核酸適配體在感染性疾病病原學(xué)診斷中的應(yīng)用

感染性疾病的病情進(jìn)展大多較快，有效的治療往往要以明確的診斷為前提，因此早期和精確的診斷具有重要意義。目前，臨床上采用的病原體檢測(cè)方法主要有3類(lèi)：一類(lèi)是在患者的相應(yīng)樣本中借助顯微鏡或電子顯微鏡等直接尋找病原體或做病原體培養(yǎng)；第二類(lèi)為以PCR為代表的分子生物學(xué)診斷技術(shù)；第三類(lèi)是以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)為代表的免疫學(xué)診斷技術(shù)。

直接尋找或培養(yǎng)病原體對(duì)樣本要求高，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，在應(yīng)用上有較大限制。利用PCR等分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)病原體核酸具有極高的靈敏度，但對(duì)儀器和試劑保存條件、環(huán)境的要求高，容易因?qū)嶒?yàn)污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性，檢測(cè)成本也較高。ELISA等免疫學(xué)方法在臨床上使用較多，主要檢測(cè)病原體抗原或機(jī)體內(nèi)針對(duì)病原體的抗體，其在檢測(cè)靈敏度、成本和檢測(cè)速度上整體較好，因而被普遍應(yīng)用。但對(duì)某些服用免疫抑制劑、免疫功能低下及處于感染早期和窗口期的患者，其機(jī)體內(nèi)可能不會(huì)出現(xiàn)特異性抗體，這是通過(guò)檢測(cè)抗體進(jìn)行診斷的免疫學(xué)方法無(wú)法回避的問(wèn)題[7]。再者，ELISA 必須基于清楚知曉檢測(cè)對(duì)象的特異性標(biāo)記(特異性抗原或抗體)方能成立。

針對(duì)上述問(wèn)題，基于核酸適配體的檢測(cè)能給出較好的解決方案。核酸適配體對(duì)靶分子的特異性極高，且靶分子范圍極廣，其靶標(biāo)不僅可以是抗體等晚期標(biāo)記，也可以是病原體核酸、表面蛋白等早期標(biāo)記，這為早期檢測(cè)病原體創(chuàng)造了條件。核酸適配體在確定序列后，可通過(guò)化學(xué)方法批量制備，由于性質(zhì)穩(wěn)定，其后續(xù)存儲(chǔ)也較方便，整體成本低。綜合來(lái)看，核酸適配體在病原體檢測(cè)中是大有可為的。

2.1 病毒感染的檢測(cè)

目前，核酸適配體可檢測(cè)病毒已有很多報(bào)道，包括人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、人乳頭瘤病毒、部分肝炎病毒、部分流感病毒和埃博拉病毒等[8]。Xi等[9]經(jīng)過(guò)13輪篩選，獲取了針對(duì)乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)的核酸適配體，并結(jié)合磁性分離和免疫分析技術(shù)構(gòu)建了一種化學(xué)發(fā)光核酸適配體傳感器。其對(duì)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)具有極高的特異度和檢測(cè)精度，在有干擾物質(zhì)存在時(shí)，對(duì)HBsAg的檢測(cè)靈敏度仍達(dá)到 0.1 ng/mL。流感病毒感染性強(qiáng)，其基因易突變，幾乎每一種新亞型流感病毒剛出現(xiàn)時(shí)都會(huì)引發(fā)局部甚至全球范圍的流感大流行。對(duì)控制疾病流行和疾病治療而言，早期確診流感病毒感染十分關(guān)鍵。Tseng等[10]基于微流體技術(shù)，構(gòu)建了一套診斷甲型H1N1流感病毒的雙核酸適配體熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其對(duì)病毒具有高度特異性和親和力，檢測(cè)靈敏度較現(xiàn)有商品化的流感快速診斷試驗(yàn)(rapid influenza diagnostic test)高出約30倍，檢測(cè)時(shí)間也只需30 min左右。同時(shí)，得益于微流體技術(shù)，這種檢測(cè)僅需極其微量的樣本和試劑即可完成，大大降低了檢測(cè)成本和對(duì)樣本的要求。該研究組后續(xù)還利用熒光修飾的通用性核酸適配體結(jié)合微流體技術(shù)，開(kāi)發(fā)了可檢測(cè)甲型H1N1流感、甲型H3N2流感、乙型流感病毒(influenza B virus)這3種病毒的通用檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)時(shí)間僅需20 min，遠(yuǎn)低于常規(guī)檢測(cè)方法[11]。

2.2 細(xì)菌感染的檢測(cè)

利用核酸適配體對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)已有諸多報(bào)道，可檢測(cè)的細(xì)菌包括沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、空腸彎曲桿菌、溶血性鏈球菌、志賀痢疾桿菌及銅綠假單胞菌等。這些檢測(cè)體系均具有極高的檢測(cè)靈敏度，部分檢測(cè)靈敏度可達(dá)1～10 CFU/mL[12-13]。以金黃色葡萄球菌檢測(cè)為例，Abbaspour等[14]創(chuàng)建了一套基于電化學(xué)傳感器的雙核酸適配體夾心檢測(cè)體系，即先將生物素化的核酸適配體固定在親和素標(biāo)記的磁珠上構(gòu)成捕獲探針，再用另一種核酸適配體與銀納米顆粒綴合構(gòu)成檢測(cè)探針。檢測(cè)時(shí)，待測(cè)樣本中的金黃色葡萄球菌可結(jié)合900～1 200 個(gè)捕獲探針和1 500～2 300 個(gè)檢測(cè)探針，使得該體系檢測(cè)低限達(dá)到1 CFU/mL，遠(yuǎn)超常規(guī)檢測(cè)方法。

2.3 檢測(cè)被感染細(xì)胞表面的標(biāo)記

除直接檢測(cè)病原體組分和抗體外，核酸適配體還可提供一種獨(dú)特的檢測(cè)方式，即檢測(cè)被病原體感染的細(xì)胞。較之于正常細(xì)胞，癌變或被病原體感染的細(xì)胞表面分子往往會(huì)發(fā)生一些特征性改變，由此產(chǎn)生的某些標(biāo)記可作為核酸適配體識(shí)別的靶標(biāo)，用于疾病診斷。此種類(lèi)型的診斷方式目前主要用于核酸適配體對(duì)腫瘤性疾病的診斷，診斷寄生蟲(chóng)感染也有報(bào)道[15-16]。Parekh等[17]和Tang等[18]利用SELEX技術(shù)，以病毒感染細(xì)胞表面的糖基化血凝素為靶標(biāo)，成功篩選出了能特異性識(shí)別牛痘病毒感染細(xì)胞的核酸適配體，使用熒光染料標(biāo)記核酸適配體后，可在熒光顯微鏡下直接檢測(cè)。這種檢測(cè)方式流程簡(jiǎn)單，有望用于某些病原體的快速診斷。

3 核酸適配體在感染性疾病治療中的研究進(jìn)展

由于抗生素的濫用，耐藥菌株大量出現(xiàn)，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬(wàn)古霉素腸球菌及多重耐藥的銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌等。面對(duì)這些耐藥菌株引起的感染與相應(yīng)臨床疾病，臨床醫(yī)師往往束手無(wú)策。病毒由于基因變異也易對(duì)抗病毒藥物產(chǎn)生耐藥性，且目前臨床上使用的抗病毒藥物大多存在不良反應(yīng)。因此，開(kāi)發(fā)新型抗感染藥物仍是感染性疾病領(lǐng)域的重要研究課題。

3.1 細(xì)菌感染性疾病的治療

研發(fā)可替代抗生素的新型抗菌藥物備受關(guān)注。相關(guān)研究顯示，核酸適配體具有開(kāi)發(fā)為抗菌藥物的潛力。核酸適配體治療細(xì)菌感染性疾病的機(jī)制主要有以下幾方面。

3.1.1靶向細(xì)菌生理過(guò)程的關(guān)鍵分子Baig等[19]篩選獲取了靶向結(jié)合結(jié)核分枝桿菌中乙酰羥酸合成酶的核酸適配體。該核酸適配體可抑制乙酰羥酸合成酶的活性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗結(jié)核分枝桿菌的作用。該研究中核酸適配體顯示出極高的抑菌效果，在納摩爾濃度級(jí)別即可抑制乙酰羥酸合成酶90%的活性，有望開(kāi)發(fā)為新型抗結(jié)核藥物。對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的細(xì)菌主要是由于其能產(chǎn)生分解抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，因而治療此類(lèi)細(xì)菌引起的感染時(shí)，可將抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用。Kim等[20]獲取了對(duì)蠟狀芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶具有極高特異性的單鏈DNA適配體，這兩種核酸適配體對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制常數(shù)Ki分別為 0.92 和 0.31 nmol/L，均在納摩爾級(jí)別，可作為有效的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。

3.1.2調(diào)控機(jī)體對(duì)細(xì)菌的免疫反應(yīng)Chen等[21]通過(guò)SELEX技術(shù)獲取了抗結(jié)核分枝桿菌H37Rv的DNA適配體。該DNA適配體可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞內(nèi)γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)的分泌，并抑制結(jié)核分枝桿菌對(duì)CD8+T細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的侵襲，從而發(fā)揮抗菌作用。在小鼠模型中，對(duì)照組小鼠注射H37Rv后的半數(shù)死亡時(shí)間為13 d，而經(jīng)注射核酸適配體治療的實(shí)驗(yàn)組小鼠的半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)了3 d左右。組織病理學(xué)顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)核酸適配體治療的小鼠肺組織病理變化明顯減輕。Kristian等[22]的研究則提供了一種全新的抗菌治療思路。與其他哺乳動(dòng)物不同，人體細(xì)胞不表達(dá)α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，α-GAL)受體。但由于受腸道菌群帶有的α-GAL刺激，人體體液中存在相應(yīng)α-GAL抗體。Kristian等將靶向A群鏈球菌(group AStreptococcus，GAS)表面M蛋白的核酸適配體與GAL綴合，結(jié)果顯示，在該核酸適配體與細(xì)菌結(jié)合后，與核酸適配體結(jié)合的GAL可介導(dǎo)吞噬細(xì)胞對(duì)GAS的吞噬殺傷作用，有利于清除細(xì)菌。

3.1.3靶向細(xì)菌分泌的致病物質(zhì)一些細(xì)菌入侵機(jī)體后，主要靠菌體分泌的毒素和酶等引起機(jī)體病理反應(yīng)，清除這些致病物質(zhì)也是治療的重要部分。金黃色葡萄球菌可分泌多個(gè)不同血清型的超抗原腸毒素，極微量的腸毒素即可激活大量T細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)中毒性休克綜合征(toxic shock syndrome，TSS)，因此阻斷腸毒素的作用對(duì)金黃色葡萄球菌感染的治療具有十分重要的意義。Wang等[23]通過(guò)SELEX技術(shù)獲取了對(duì)葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)高親和力的核酸適配體拮抗劑A11，可有效阻斷SEB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。在小鼠模型中，注射SEB誘導(dǎo)小鼠發(fā)生TSS，36 h存活率為50%，而提前注射A11的小鼠36 h存活率高達(dá)90%。隨后，該課題組又獲取了針對(duì)葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)的核酸適配體拮抗劑S3，在注射SEA誘導(dǎo)小鼠發(fā)生TSS的模型中，對(duì)照組小鼠36 h存活率為26%，而治療組小鼠于注射SEA 30 min后再注射S3，其36 h存活率達(dá)76%[24]。這些結(jié)果表明，核酸適配體可有效阻斷腸毒素的致炎效應(yīng)，控制TSS，在開(kāi)發(fā)感染控制藥物方面極具潛力。

3.2 病毒感染性疾病的治療

目前，通過(guò)核酸適配體治療病毒(如HIV-1、肝炎病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒)感染性疾病等方面已有大量基礎(chǔ)研究[25]。核酸適配體主要通過(guò)以下幾種方式抑制病毒的復(fù)制過(guò)程或促進(jìn)細(xì)胞的抗病毒作用：①與病毒的表面蛋白及其識(shí)別的細(xì)胞受體結(jié)合，阻斷病毒對(duì)細(xì)胞的黏附過(guò)程，如靶向流感病毒包膜上血凝素的抗流感病毒核酸適配體[26]。②靶向病毒基因組表達(dá)過(guò)程的關(guān)鍵酶和蛋白質(zhì)，抑制病毒的復(fù)制過(guò)程，如通過(guò)結(jié)合病毒甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)而抑制登革熱病毒的核酸適配體[27]。③將核酸適配體與治療性分子如核酸酶、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)等結(jié)合，構(gòu)成以核酸適配體為遞送工具和以治療性分子為治療配基的靶向藥物。在開(kāi)發(fā)HIV-1治療藥物方面，靶向CD4和gp120的核酸適配體與siRNA的嵌合物顯示出良好的應(yīng)用潛力[28]。④通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的抗病毒信號(hào)通路，促進(jìn)免疫應(yīng)答。維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)蛋白是細(xì)胞內(nèi)識(shí)別病毒核酸的受體，主要被5′端有三磷酸修飾的RNA激活，可介導(dǎo)機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)。Hwang等[29]篩選出了一種RNA適配體，可特異性靶向激活RIG-Ⅰ，促進(jìn)β干擾素(interferon β，IFN-β)的表達(dá)，發(fā)揮抗病毒作用。雖然目前尚未有抗病毒核酸適配體藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但核酸適配體在抗病毒藥物開(kāi)發(fā)中的潛力值得關(guān)注和進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語(yǔ)

核酸適配體在感染性疾病診治領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力已得到廣泛認(rèn)可，在目前感染性疾病診治形勢(shì)仍然嚴(yán)峻的情況下，尤其值得關(guān)注。核酸適配體應(yīng)用的發(fā)展也存在一些問(wèn)題，如利用SELEX技術(shù)篩選針對(duì)靶分子的核酸適配體時(shí)，成功率較低，可投入實(shí)際運(yùn)用的核酸適配體更是少之又少。另一方面，作為藥物時(shí)，核酸較小的相對(duì)分子質(zhì)量賦予了核酸適配體較好的組織穿透性和較低的免疫原性，但也使得核酸適配體在機(jī)體內(nèi)易被腎臟過(guò)濾和核酸酶降解，往往需對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)修飾，以延長(zhǎng)半衰期，這也提高了核酸適配體應(yīng)用的門(mén)檻。

為提高核酸適配體篩選的效率和成功率，已發(fā)展出一些改進(jìn)型SELEX技術(shù)，但相關(guān)研究較困難，進(jìn)展緩慢。研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)移至核酸適配體的應(yīng)用后，研究上游SELEX技術(shù)發(fā)展的問(wèn)題可能進(jìn)一步凸顯，成為制約核酸適配體應(yīng)用的瓶頸，值得學(xué)界關(guān)注。核酸適配體修飾已有許多方式，如通過(guò)連接聚乙二醇基團(tuán)，適當(dāng)增加核酸適配體相對(duì)分子質(zhì)量，以延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間；用氟原子和甲氧基等取代核苷酸中的羥基，能增強(qiáng)核酸適配體對(duì)核酸酶的抵抗能力，提高其半衰期。但繁多的修飾方式并不利于降低成本和核酸適配體應(yīng)用的發(fā)展，未來(lái)在核酸適配體修飾領(lǐng)域還是應(yīng)尋求通用化的解決方案?？傮w來(lái)說(shuō)，在感染性疾病診斷的初步應(yīng)用中，核酸適配體在早期檢測(cè)、成本及靈敏度等方面有優(yōu)異表現(xiàn)。待相關(guān)技術(shù)成熟，核酸適配體極有可能顛覆當(dāng)前醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域中以抗原抗體反應(yīng)為主的檢測(cè)體系。在疾病治療方面，核酸適配體距臨床應(yīng)用尚有一段距離，不過(guò)基礎(chǔ)研究已證明核酸適配體在抗病原體感染中的價(jià)值。相信隨著SELEX技術(shù)、核酸適配體改造修飾方法等的進(jìn)一步發(fā)展，未來(lái)核酸適配體極有可能像抗體一樣在感染性疾病領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，成為下一代診療技術(shù)的載體。