雞大腸桿菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

哈力旦木·吾甫爾，牙合甫·阿不力孜

（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心），烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊 830011）

0 引言

為有效控制雞大腸桿菌病的流行和傳播，控制致病菌產(chǎn)生耐藥性，臨床上初步鑒定為大腸桿菌病后，要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原微生物的分離鑒定、藥敏試驗(yàn)等工作，以便快速開(kāi)展合理的診療措施，減少損失。

1 材料與方法

1.1 材料選取

本次研究選擇了新疆某鄉(xiāng)鎮(zhèn)的患病肉雛雞，該養(yǎng)殖場(chǎng)于2017年1月13日發(fā)病，出現(xiàn)患病雞后，病情迅速擴(kuò)展蔓延，并出現(xiàn)了嚴(yán)重的死亡現(xiàn)象。養(yǎng)殖戶衛(wèi)生條件較差、飼養(yǎng)不當(dāng)、疫苗免疫不科學(xué)，導(dǎo)致疫病在較短時(shí)間內(nèi)向整個(gè)雞舍的雞群傳播流行。發(fā)病后，養(yǎng)殖戶將患病雞隔離，自行選擇青霉素、鏈霉素進(jìn)行治療，但并沒(méi)有收到明顯的效果。隨后養(yǎng)殖戶將病情上報(bào)了當(dāng)?shù)孬F醫(yī)單位，獸醫(yī)到達(dá)養(yǎng)殖場(chǎng)后，無(wú)菌采集病料在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原微生物分離鑒定和藥敏試驗(yàn)。

試驗(yàn)器材：濾紙、打孔器、帶瓶塞的廣口瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、干燥箱、冰箱、天平、無(wú)菌蒸餾水、顯微鏡、載玻片、酒精燈、吸水紙、平皿、接種環(huán)、注射器、離心管、鑷子、棉簽。

試驗(yàn)試劑：革蘭氏染色劑、香柏油、二甲苯、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（LB）、三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基（TSI）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）、蛋白胨、葡萄糖蛋白胨、醋酸鉛瓊脂培養(yǎng)基。細(xì)菌微量生化鑒定管：葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發(fā)酵管、甲基紅指示劑、VP指示劑、吲哚試劑。用于藥敏試驗(yàn)的抗生素主要包括慶大霉素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、鏈霉素、青霉素、磺胺嘧啶鈉、阿莫西林。

1.2 試驗(yàn)方法

將抗生素用蒸餾水充分稀釋后，制備藥敏紙片備用，用樣本分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無(wú)菌蘸取病料接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～24 h，觀察并記錄菌落的生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 革蘭氏染色鏡檢

潔凈的載玻片上先滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)蘸取少量單菌落于蒸餾水中，在載玻片上涂抹均勻后用酒精燈外焰進(jìn)行固定。按照革蘭氏染色步驟：初染，結(jié)晶紫1 min，沖洗；媒染，革蘭氏碘液1 min，沖洗；脫色，95%酒精30 s，沖洗；復(fù)染，番紅1 min，沖洗并用吸水紙吸干多余水分，載玻片晾干后放置在顯微鏡油鏡下觀察[1]。

1.2.3 三糖鐵斜面接種試驗(yàn)

將分離得到的致病菌，用接種環(huán)轉(zhuǎn)移到三糖鐵斜面培養(yǎng)基上，先將致病菌均勻涂布在斜面后，然后再穿刺底層。培養(yǎng)基放置在恒溫箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察斜面底部的顏色變化情況，是否產(chǎn)氣、是否產(chǎn)生硫化氫氣體。用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發(fā)酵管以及甲基紅指示劑、VP指示劑、吲哚試劑、香柏油、二甲苯進(jìn)行生化試驗(yàn)[2]。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

無(wú)菌環(huán)境下使用接種環(huán)取培養(yǎng)基菌落1～2個(gè)，放入盛有1 mL滅菌生理鹽水的離心管內(nèi)，充分混合均勻后，用無(wú)菌棉簽沾取溶液，棉簽在管壁上用力擠壓，除去多余液體，均勻涂布在瓊脂營(yíng)養(yǎng)平板上，室溫環(huán)境干燥，5 min后，放入提前制備好的藥敏紙片，并輕輕按壓至能與瓊脂平板充分緊貼，牢固后不能再移動(dòng)，并做好標(biāo)記。試驗(yàn)注意紙片放置均勻，各個(gè)紙片中心距離不得小于2.5 cm，藥敏試驗(yàn)的紙片距離平板內(nèi)緣不得少于15 mm。將制備好的平板在室溫條件下，放置10 min，再倒置于37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離

接種試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，從養(yǎng)殖場(chǎng)采集回來(lái)的病料，能夠在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，能夠生長(zhǎng)出圓形、濕潤(rùn)、光滑、半透明、灰白色、中間突起、成露珠狀的致病菌菌落。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上能生成中間稍微隆起、邊緣整齊、濕潤(rùn)、光滑，直徑在1.5 mm左右的粉紅色的致病菌菌落，符合大腸桿菌的病原菌分離特性。

2.2 染色鏡檢

將分離得到的致病菌進(jìn)行常規(guī)革蘭氏染色后放置在顯微鏡下，鏡檢可以發(fā)現(xiàn)致病菌為兩端鈍圓、個(gè)體中等大小的桿菌，成對(duì)或散在存在，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，不能運(yùn)動(dòng)，革蘭氏陰性染色，符合大腸桿菌的染色特性。

2.3 生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，葡萄糖發(fā)酵管、甘露醇發(fā)酵管和三糖鐵斜面培養(yǎng)基產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使培養(yǎng)溶液顏色發(fā)生改變，表面產(chǎn)生大量氣泡。不能發(fā)酵蔗糖，能夠發(fā)酵麥芽糖、乳糖。甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，VP試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)陰性。

2.4 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)抑菌圈的大小作為判定該種抗生素對(duì)致病菌敏感性高低的標(biāo)準(zhǔn)[3]，結(jié)果如表1所示。分離得到的致病菌對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感，對(duì)阿奇霉素、磺胺嘧啶鈉中敏，對(duì)青霉素、鏈霉素、阿莫西林不敏感，這也是養(yǎng)殖戶選擇青霉素、鏈霉素治療沒(méi)有取得明顯效果的主要原因。同時(shí)，只有慶大霉素和環(huán)丙沙星比較敏感。因此，在明確致病原、開(kāi)展藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，引導(dǎo)養(yǎng)殖戶選擇使用慶大霉素、環(huán)丙沙星輪換交替進(jìn)行防治，在較短時(shí)間控制了病情，減少養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失。

表1 常見(jiàn)抗生素敏感程度

3 討論

本次研究通過(guò)病原分離、涂片鏡檢、藥敏試驗(yàn)等對(duì)該場(chǎng)的發(fā)病雞初步診斷為大腸桿菌病，但由于實(shí)驗(yàn)室能力有限，不能對(duì)大腸桿菌血清學(xué)開(kāi)展診斷，沒(méi)有明確致病性大腸桿菌的血清類(lèi)型，這是今后工作中需要進(jìn)一步努力的地方。同時(shí)，進(jìn)一步藥敏試驗(yàn)還可以發(fā)現(xiàn)，從該養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到的大腸桿菌，對(duì)阿奇霉素、磺胺嘧啶鈉呈現(xiàn)一定的耐藥性，鏈霉素、青霉素、阿莫西林對(duì)該種致病菌不具備任何抑菌效果，只有慶大霉素、環(huán)丙沙星具有較高的敏感性。由于養(yǎng)殖戶不合理使用抗生素所致，今后養(yǎng)殖中需要引導(dǎo)養(yǎng)殖戶合理用藥，嚴(yán)格控制抗生素的使用。

4 結(jié)束語(yǔ)

在今后養(yǎng)殖中，要引導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)用藥，加強(qiáng)對(duì)雞大腸桿菌病的預(yù)防，堅(jiān)持預(yù)防為主、防治相結(jié)合的理念。同時(shí)，還要強(qiáng)化飼養(yǎng)管理，為雞群營(yíng)造一個(gè)健康、舒適、整潔的環(huán)境，控制好飼養(yǎng)密度，強(qiáng)化通風(fēng)換氣，及時(shí)清理糞便，制定嚴(yán)格的衛(wèi)生消毒措施，定期消毒。