喉癌組織中CD3表達(dá)的研究

李滿意 劉濟(jì)生 周慧 吳文瓔 肖根生 于亞峰

頸部腫瘤約占全身腫瘤的5%。最常見的喉癌的組織學(xué)類型是鱗狀細(xì)胞癌。不同的研究項目表明T淋巴細(xì)胞可能在腫瘤發(fā)生中有重要意義[1]。iNKT細(xì)胞是一種新的T細(xì)胞亞群，對抗腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性。iNKT細(xì)胞數(shù)量占CD3+ T細(xì)胞總量的0.005%～0.200%。一般來說，NKT細(xì)胞的定義是表達(dá)T細(xì)胞受體和NK細(xì)胞分子在其表面（如CD161）的CD3+ T細(xì)胞。 NKT細(xì)胞分為I型、II型和NKT樣細(xì)胞。NKT樣細(xì)胞是一種具有記憶表型的T細(xì)胞亞群。目前癌癥TNM分類及組織學(xué)亞型，是臨床治療決策和評估預(yù)后可用的最可靠的指南。然而，臨床經(jīng)常遇到許多患者TNM分期及組織學(xué)亞型相同，治療方案相同，預(yù)后結(jié)果可能會不同。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs），可能嚴(yán)重影響著癌癥患者預(yù)后結(jié)果。一些研究提出“免疫微環(huán)境”，包括免疫細(xì)胞類型、密度和免疫細(xì)胞的分布，都以有利或有害的方式影響腫瘤患者的預(yù)后[2]。特別是腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs），在人類許多惡性腫瘤中與改善生存預(yù)后關(guān)系密切[3]。在結(jié)直腸癌病灶中，對CD3+的CD8+ TIL T細(xì)胞浸潤的密度和分布研究，發(fā)現(xiàn)用以評估腫瘤患者預(yù)后，比傳統(tǒng)TNM分期及組織學(xué)分類更為精準(zhǔn)[3]。本研究的目的是初探CD3+的CD8+ TIL T細(xì)胞在喉鱗癌病灶、正常喉黏膜中的分布情況及二者間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

本研究選取蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科選擇2013年1月1日—2016年12月31日的手術(shù)治療及病理證實(shí)50例喉癌為喉癌組，10例正常喉黏膜作為對照組。喉癌組：男性49例，女性1例，年齡42～84歲，平均為（56.0±3.6）歲。術(shù)前均未行術(shù)前放療及全身化療，所有患者術(shù)前均簽署知情同意書。病理分級：高分化18例，中分化20例，低分化12例，病理檢查為鱗癌，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。TNM分期是根據(jù)1987年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第四版進(jìn)行的，其中，包括I期17例，II期9例，III期14例，IV期10例；聲門上型12例，聲門型30例，聲門下型8例。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片 先脫蠟，再重新進(jìn)行使用標(biāo)準(zhǔn)方案水化，通常在10 ml檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中溫育來進(jìn)行.后用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，再將它們浸入3%過氧化氫溶液中10分鐘以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。通過孵育，用5%正常山羊或兔血清20分鐘阻斷非特異性抗體結(jié)合。然后添加CD3抗體（福建邁新生物科技有限公司）在4℃孵育過夜，后載玻片用PBS洗滌，用辣根過氧化物酶（北京中山生物技術(shù)有限公司）通過溫育檢測抗體結(jié)合，加二氨基聯(lián)苯胺溶液一滴，用蘇木精復(fù)染。

1.2.2 免疫組化方法 本研究采用SP法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，免疫組化檢測設(shè)定陽性、陰性和空白對照。

1.2.3 結(jié)果標(biāo)準(zhǔn) 在喉癌中，CD3免疫染色得分如下：得分（-）：在腫瘤的任何部分都未檢測到染色。評分（+）：0%～25%的腫瘤細(xì)胞呈陽性染色。評分（++）：25%～50%的腫瘤細(xì)胞呈陽性染色。評分（+++）：50%～75%的腫瘤細(xì)胞呈陽性染色。評分（++++）：75%～100%的腫瘤細(xì)胞呈陽性染色。隨機(jī)觀察至少10個高倍視野（10×40）中的每一個的喉鱗狀細(xì)胞癌和正常組織切片。以上所有由病理學(xué)家進(jìn)行雙盲閱讀并記錄所有切片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示；計數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗，采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

CD3在喉癌中的表達(dá)：從表1可見，喉癌組CD3的陽性表達(dá)率和陰性表達(dá)率為84.0%，高于正常對照組（正常喉黏膜）陽性率為20.0%。喉癌組織中CD3的陽性表達(dá)率與正常喉黏膜組織的陽性表達(dá)率對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1～3）CD3與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分區(qū)、性別呈負(fù)相關(guān)，與年齡分組、T分類、病理分化程度、臨床分期無明顯相關(guān)性（表2）。

表1 CD3在喉癌組織和正常喉部黏膜中的表達(dá) [n（%）]

表2 CD3表達(dá)與喉癌臨床病理特征的關(guān)系（n）

圖 1 （SP staining，×200）正常喉黏膜中見極少量CD3表達(dá)

圖 2（SP staining，×200） 喉癌組織中見較多CD3表達(dá)

圖 3 （SP staining，×200）有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移喉癌組織中見少量CD3

3 討論

研究已證實(shí)小鼠和人類的腫瘤病灶內(nèi)都存在著免疫細(xì)胞的浸潤。通過對免疫缺陷小鼠的實(shí)驗證明了適應(yīng)性免疫應(yīng)答在癌癥免疫監(jiān)視中的作用。腫瘤細(xì)胞可以表達(dá)抗原并成為T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的靶點(diǎn)。在小鼠的實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞似乎在阻止腫瘤的發(fā)生并抑制腫瘤的進(jìn)展[4]?？鼓[瘤免疫也同時會引起免疫編輯，這促使腫瘤細(xì)胞降低免疫原性從而利于腫瘤的生長.截至目前，人類腫瘤病灶中免疫細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制尚不十分清楚。免疫細(xì)胞可以釋放炎癥介質(zhì)，發(fā)揮促血管生成和促腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的作用[4，6]。黑色素瘤、結(jié)直腸癌和卵巢癌中的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞已被證明具有抑制腫瘤細(xì)胞生長功能，并可以一定程度上改善腫瘤患者的預(yù)后[5-7]。接受抗原刺激后，小部分抗原特異性記憶T細(xì)胞仍存在于病變組織中這些抗原特異性記憶T細(xì)胞通過適應(yīng)性免疫應(yīng)答在阻止腫瘤復(fù)發(fā)中起重要作用。結(jié)直腸早期腫瘤內(nèi)高浸潤密度的T細(xì)胞不僅可以抑制腫瘤細(xì)胞向淋巴管和周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)侵犯，而且可以降低腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率[8]。由此可以猜測在腫瘤早期階段，其復(fù)發(fā)時間和總體生存率在一定程度上決定于局部適應(yīng)性免疫狀態(tài)。這也就可以解釋為什么一些Ⅰ期和Ⅱ期喉癌患者預(yù)后較差的原因。有研究報道50例下唇癌患者，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的分布密度與腫瘤的侵襲程度呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)喉鱗狀細(xì)胞癌中CD3的過表達(dá)和正常喉黏膜中CD3的低表達(dá)，表明CD3是喉癌組織依賴性表達(dá)。喉癌組織中CD3的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。CD3與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（r=-0.823，P＜0.05）。盡管本研究不能得出CD3+ T細(xì)胞和腫瘤侵襲程度的確切關(guān)系，但是可以初步確認(rèn)的是，CD3+ T細(xì)胞和腫瘤侵襲程度二者可以互為補(bǔ)充，更為準(zhǔn)確的評估腫瘤的復(fù)發(fā)和生存率。值得注意的是，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞與腫瘤侵襲程度分期二者任何一個都不能針對所有腫瘤患者作出關(guān)于復(fù)發(fā)及預(yù)后的準(zhǔn)確評估。故不妨可考慮同時應(yīng)用二者對腫瘤患者進(jìn)行分層風(fēng)險評估。既往許多研究與本研究結(jié)果都提示原發(fā)腫瘤的浸潤深度直接關(guān)系著腫瘤的潛在轉(zhuǎn)移率?？傊?，本研究提示聯(lián)合應(yīng)用CD3檢測及TNM分期、組織學(xué)分級可能對喉鱗癌的復(fù)發(fā)、預(yù)后作出更為準(zhǔn)確的評估。

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