A型肉毒素重鏈干預(yù)對大鼠脊髓損傷后生長相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

王亞芳，蘭 婧，劉 福，白 娟，李夏青

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，太原 030001)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是指各種創(chuàng)傷或非創(chuàng)傷因素引起的損傷平面以下運(yùn)動、感覺和自主神經(jīng)功能不同程度的喪失。由于成年哺乳動物脊髓損傷后再生能力極為有限[1-2]，損傷后再生障礙，脊髓損傷后致殘率極高，嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量[3]。脊髓損傷后之所以不能再生的原因歸結(jié)于脊髓損傷后局部大量軸突再生抑制因子的產(chǎn)生及損傷脊髓組織內(nèi)軸突再生相關(guān)基因不能上調(diào)或激活、細(xì)胞或軸突再生相關(guān)蛋白合成障礙[4-5]。

A型肉毒桿菌毒素(botulinum neurotoxin serotype A，BoNT/A)是由肉毒桿菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素之一[6-7]。A型肉毒素的毒性機(jī)理主要基于其可選擇性地與運(yùn)動終板神經(jīng)突觸前膜上相應(yīng)受體結(jié)合入胞、導(dǎo)致突觸囊泡蛋白25(synaptosomal-associated protein 25, SNAP-25)裂解、阻斷囊泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)(乙酰膽堿)的釋放[8-9]，致使所支配的骨骼肌收縮障礙發(fā)生麻痹[10]。除影響乙酰膽堿外，肉毒素也可抑制或阻止突觸囊泡內(nèi)其它物質(zhì)的釋放，譬如：降鈣素基因相關(guān)多肽(CGRP)、P物質(zhì)等[11]。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上，A型肉毒素是由二硫鍵相連的雙肽鏈，其中較長的一條位于毒素氨基端，稱為重鏈(heavy chain，HC), 負(fù)責(zé)與靶細(xì)胞膜結(jié)合及介導(dǎo)毒素的內(nèi)吞；較短的一條位于毒素的氨基側(cè)，稱為輕鏈(light chain，LC)。輕鏈部分具有Zn+依賴的蛋白水解酶活性，是毒素的毒性催化單位[12-13]。一些在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A型肉毒素引起肌肉麻痹的恢復(fù)期(注射后3～4月)，隨著肌肉功能的逐漸恢復(fù)，局部組織內(nèi)可見運(yùn)動終板樣神經(jīng)末梢結(jié)構(gòu)[14]。因此，根據(jù)BoNT/A化學(xué)結(jié)構(gòu)的功能特征，在去除輕鏈的毒性作用后，BoNT/A重鏈本身也可能影響神經(jīng)細(xì)胞的多種功能及其結(jié)構(gòu)變化[15]。

為此，本文擬在大鼠脊髓損傷模型的基礎(chǔ)是，采用人工重組的 BoNT/A重鏈進(jìn)行髓腔內(nèi)間斷性給藥，探討其對脊髓損傷后生長相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及其促進(jìn)神經(jīng)突起再生的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠，6～7周齡，體重200～220 g, 由北京海淀實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場提供[SCXK(京) 2014-0013]。所有動物在本實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立動物房飼養(yǎng)[SYXK(晉)2015-0001]，室溫(24±1)℃，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，每日提供充足的標(biāo)準(zhǔn)食物與飲水。動物的使用及操作按照本校動物管理委員會(IACUC2017-001)的規(guī)定執(zhí)行，在使用動物的過程中充分考慮動物福利原則，尊重動物，善待動物，最大程度減少對動物的傷害和痛苦。

1.2 主要試劑和儀器

A型肉毒素重鏈購自美國List Biological Laboratories, Inc;PE-10(RWD Life Science，62324，China)；多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices, SpectraMax@190，USA);多功能電泳儀(Bio-Rad, USA); Bradford 法蛋白濃度測定試劑盒 (Sangon Biotech, C503031，China);EasySee Western blot kit (TRAN, DW101, China);兔抗磷酸化GAP43單克隆抗體(Thermo Fisher, PAI-4626,USA)；兔抗SCG 10多克隆抗體(Thermo Fisher, 720178, USA)；兔抗-GAPDH 多克隆抗體 (Bioword, AP0063, China)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(Bioword, AP0063, China)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA);冰凍切片機(jī)(Leica, 1950-Cryostat, Germany);兔抗磷酸化GAP 43單克隆抗體(Bioword, BS4791, China)；Alexa Fluor 594結(jié)合的羊抗兔IgG 二抗 (Lifetechnologies, A11012, USA)； Alexa Fluor 488結(jié)合的驢抗兔IgG 二抗(Lifetechnologies, A21206, USA)；抗衰變熒光封片劑 (Invitrogen，P36931, USA)；熒光倒置顯微鏡(Olympus IX71，Japan)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腰段脊髓半橫斷損傷模型建立

將全身麻醉后的大鼠后背位固定于鼠臺，剃去背部被毛，以髂前上棘確定L3～L4椎間隙，并依次向上確定T9～T10椎間隙。以T9～T10為中心，沿背部正中皮膚切開2～3 cm的切口，分離脊柱周圍肌肉筋膜，暴露椎板，剪去T9棘突并用咬骨鉗移除T9椎板，暴露脊髓。以脊髓正中靜脈為標(biāo)志，在顯微鏡下，用眼科鑷子從脊髓正中靜脈左側(cè)插入直至椎板，橫向夾斷脊髓。止血消毒后逐層縫合肌肉筋膜及皮膚。蘇醒后的大鼠呈現(xiàn)左后肢拖地行走、抓力顯著下降、熱痛敏時間無限延長。動物置于溫暖環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)終止。

1.3.2 BoNT/A重鏈給藥及實(shí)驗(yàn)分組

通過兩個部位間斷給予BoNT/A重鏈制劑：(1)損傷局部給藥：于損傷同時局部給予BoNT/A重鏈4 μg(4 μg/4 μL)；(2)腰骶部鞘內(nèi)置管給藥[16]：模型建立后每周給予BoNT/A重鏈2 μg(2 μg/2 μL)。BoNT/A重鏈制劑配置：50 μL 0.9%的醫(yī)用無菌生理鹽水溶入一支A型肉毒素重鏈凍干粉中(50 μg),震蕩搖勻，即可配置成A型肉毒素重鏈注射液(1 μL /μg)，每次以20 μL總?cè)萘坑盟?。?shí)驗(yàn)分為3組(每組6只)：(1)假手術(shù)組(Control組)：切開皮膚，剪去椎板、暴露脊髓，但不損傷脊髓；(2)單純損傷組(Injury組)：切開皮膚，剪去椎板、暴露脊髓并行一側(cè)脊髓離斷術(shù)；(3)脊髓損傷 + BoNT/A重鏈干預(yù)組 (BoNT/A HC 組)：單側(cè)腰段脊髓離斷同時局部給予及隨后每周鞘內(nèi)給予BoNT/A重鏈制劑。根據(jù)時間點(diǎn)，單純損傷組和脊髓損傷 + BoNT/A 重鏈干預(yù)組又分為2 d、7 d、14 d和28 d組。

1.3.3 雙向電泳—硝酸銀染色檢測脊髓蛋白總體表達(dá)

各實(shí)驗(yàn)組大鼠分別在不同時間點(diǎn)(2、7、14、28 d)用1%的戊巴比妥鈉深度麻醉，沿原手術(shù)部位切開背部皮膚，打開L3～L4以上椎板至脊髓損傷部位，充分暴露脊髓。用剃須刀片切取包括損傷中心、距損傷中心上下各0.5 cm的損傷側(cè)脊髓組織。

將標(biāo)本置于預(yù)冷的蛋白裂解液(蛋白裂解液配方：尿素：21 g，硫脲：7.9 g，二硫赤鮮醇(dithioerythritol，DTE): 0.5 g, Tris: 0.5 g純水定容至50 mL)內(nèi)，用剪刀剪碎，并于玻璃研磨器內(nèi)進(jìn)行研磨制備組織懸液，隨后將組織懸液用超聲粉碎機(jī)進(jìn)一步破碎。組織懸液充分混勻后采用Bradford法測定蛋白濃度。每組標(biāo)本取150 mg蛋白，上樣于 pH 3～10 的NL IPG 預(yù)制干膠條進(jìn)行第一向等電聚焦; 將聚焦完成的膠條用2D equilibration buffer [6 mol/L尿素，50 mmol/Tris-HCl (pH 8.8)，30%甘油，2% SDS，1% DTT，痕量溴酚藍(lán)]進(jìn)行充分清洗和平衡后進(jìn)行第二向電泳(12.5%的聚丙烯酰胺凝膠)。對完成電泳后的凝膠進(jìn)行硝酸銀染色。采用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)對0.1%硝酸銀染色后的膠條進(jìn)行成像及分析處理。

1.3.4 選擇性生長相關(guān)蛋白的Western blot檢測

每組樣本取20 μg蛋白樣品上樣15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入選擇性生長相關(guān)蛋白抗體：兔抗磷酸化GAP 43單克隆抗體(1∶3000，Thermo Fisher, PAI-4626, USA)或兔抗SCG 10多克隆抗體(1∶1000), 及兔抗-GAPDH 多克隆抗體 (1∶5000)，4℃冰箱搖床過夜；TBST充分洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1000)，室溫孵育1 h，充分洗滌后加入新鮮配置發(fā)光工作液反應(yīng)3 min，暗室曝光顯影后，于凝膠成像分析系統(tǒng)上對膠片上的蛋白條帶進(jìn)行掃描及攝像分析。

1.3.5 免疫熒光檢測

各實(shí)驗(yàn)組大鼠分別在不同時間點(diǎn)(2、7、14、28 d)時在1%的戊巴比妥鈉深度麻醉下用4%多聚甲醛經(jīng)心插管灌注固定后，取出以損傷脊髓為中心長約0.5 cm的脊髓置于相同固定液中后固定1 h，移入30%的蔗糖溶液中4℃過夜。OCT包埋，制作冰凍切片。由背部向前面的額狀縱切面連續(xù)切片，厚度為16 μm。0.1% TritonX-100 穿透10 min，0.1 mol/L 的 PBS洗滌(5 min×3次)，10%正常血清封閉1 h，分別加入選擇性生長相關(guān)蛋白抗體：兔抗磷酸化GAP 43單克隆抗體(p-GAP 43，1∶100, Bioword, BS4791, China)或兔抗SCG 10多克隆抗體(1∶500)，4℃ 冰箱孵育過夜。棄去1抗，PBS 充分沖洗(5 min×3 次) 后加入二抗：Alexa Fluor 594結(jié)合的羊抗兔IgG 二抗(1∶500) 或Alexa Fluor 488結(jié)合的驢抗兔IgG 二抗(1∶500)，室溫避光孵育 1 h，PBS充分沖洗后加入含有抗衰變熒光封片劑，置于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察并采集圖片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

注：A:只行椎板切除術(shù)，暴露的脊髓及正中靜脈；B:行椎板切除術(shù)，且脊髓半橫斷；C：大鼠麻醉蘇醒后手術(shù)側(cè)后肢拖地行走；D:取出脊髓可見橫斷的斷端；A、B圖中箭頭指示暴露的脊髓和正中靜脈的位置；C圖中箭頭指示手術(shù)側(cè)后肢；D圖中箭頭指示橫斷脊髓的斷口。圖1 大鼠脊髓腰部半橫斷術(shù)大體及體態(tài)特征Note.A: Only laminectomy, spinal cord and median vein were exposed. B: Laminectomy and spinal cord hemisection. C: After anesthesia the surgery side dragging the hind leg walking. D: Hemisection of the spinal cord was visible. The arrow points to the spinal cord and the median vein (A,B). The arrow in C points to the surgical side of the hind limb. The arrow in D points to the spinal cord incision.Fig.1 Photos of the exposed spinal cord and median vein during surgery in the SCI group and the movement of the hind limb post-SCI and visible spinal cord incision

2 結(jié)果

2.1 單側(cè)腰段脊髓損傷模型的大體觀察及術(shù)后體態(tài)特征

本實(shí)驗(yàn)通過髂嵴解剖學(xué)標(biāo)志定位T9～T10椎骨，并去除第9 椎板暴露腰髓，用眼科鑷子沿脊髓正中靜脈左側(cè)夾斷一側(cè)腰髓。術(shù)后動物呈現(xiàn)左側(cè)后肢癱瘓、拖地行走，抓力及熱痛敏感覺實(shí)驗(yàn)表明大鼠運(yùn)動功能及感覺功能障礙，脊髓損傷模型成功。另外，脊髓大體特征也顯示損傷基本位于腰膨大部位(圖1)。

2.2 BoNT/A重鏈對脊髓損傷后局部蛋白總體表達(dá)譜的影響

雙向電泳及硝酸銀染色結(jié)果表明單純脊髓損傷后局部蛋白表達(dá)與正常呈現(xiàn)明顯不同。損傷后脊髓局部有些蛋白表達(dá)下降或升高，這些蛋白表達(dá)的增高和降低呈現(xiàn)單獨(dú)的蛋白表達(dá)點(diǎn)的變化，亦或者是數(shù)個點(diǎn)的變化趨勢；給予BoNT/A重鏈后局部蛋白表達(dá)的最大特點(diǎn)是：不論單純損傷時蛋白表達(dá)的變化如何，BoNT/A重鏈作用下蛋白表達(dá)皆呈現(xiàn)升高趨勢， 譬如：分子量35～45 kDa之間、等電點(diǎn)在4～5及分子量在18～25 kDa之間、等電點(diǎn)在7左右的蛋白表達(dá)點(diǎn)在單純損傷時較正常對照組增多，而采用BoNT/A重鏈后其表達(dá)進(jìn)一步增多(圖2中紅、綠箭頭所示)。

注：圖中紅綠箭頭指向差異表達(dá)的兩個蛋白點(diǎn)。圖2 分子量在18.4～45 kD左右的蛋白表達(dá)變化Note.Positions of the differentially expressed spots are indicated with red and green arrows.Fig.2 The differentially expressed proteins whose molecular weight is between 18.4-45 kD

注：與正常對照組相比，#P< 0.05；與單純損傷組相比，*P< 0.05。圖3 BoNT/A 重鏈對p-GAP 43和SCG 10表達(dá)的影響Note.Compared with the control group，#P< 0.05. Compared with the injury group, *P < 0.05.Fig.3 Effects of BoNT/A HC on the expression of p-GAP 43 and SCG 10

2.3 BoNT/A重鏈對選擇性生長相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)雙向電泳蛋白表達(dá)譜的變化，我們選取分子量接近45 kDa的磷酸化GAP-43(p-GAP 43)和分子量位于18.4～25 kDa的SCG 10作為目標(biāo)蛋白進(jìn)行免疫蛋白印跡檢測驗(yàn)證。結(jié)果顯示單純脊髓損傷2～7 d時，p-GAP 43和SCG 10的表達(dá)皆較正常偏高，而給予BoNT/A重鏈后兩個時間點(diǎn)，局部p-GAP 43和SCG 10的表達(dá)增高的趨勢更為明顯，與單純損傷組相比差異有顯著性 (P< 0.05)。隨著損傷時間的延長及連續(xù)給予BoNT/A重鏈，當(dāng)損傷時間達(dá)到14 d以上，單純損傷組和BoNT/A重鏈干預(yù)組p-GAP 43的表達(dá)皆較正常對照組下降，但BoNT/A重鏈干預(yù)組的p-GAP 43表達(dá)仍較單純損傷組為高(P< 0.05)；而對于SCG 10，當(dāng)損傷達(dá)到14 d和28 d時，其表達(dá)略有下降，而給予BoNT/A重鏈的大鼠損傷的SCG 10 表達(dá)仍呈明顯增高的現(xiàn)象(圖3)。上述結(jié)果表明脊髓損傷后給予BoNT/A重鏈可增強(qiáng)兩種選擇性生長相關(guān)蛋白的表達(dá)，其變化特征與雙向電泳結(jié)果一致。

2.4 BoNT/A 重鏈用藥后p-GAP-43和SCG 10在損傷局部的分布

注：Control、Injury和BoNT/A HC中的Bar=500 μm；Caudal和Rostral中的Bar=20 μm。圖4 BoNT/A HC對p-GAP 43和SCG 10分布的影響Note.Scale bar=500 μm in the control (left), Injury and BoNT/A HC sites. Scale bar=20 μm in the control (right), caudal and rostral sites.Fig.4 Effects of BoNT/A HC on the distribution of p-GAP 43 and SCG 10

采用免疫熒光技術(shù)分別對p-GAP 43和SCG 10在脊髓損傷局部的分布變化進(jìn)行了觀察。與western blot結(jié)果相似：在損傷后2、7 d時，脊髓損傷局部的頭尾兩端p-GAP 43和SCG 10的熒光強(qiáng)度都有所增強(qiáng)，免疫熒光陽性的部位主要分布與細(xì)胞體；但在損傷14 d后逐漸減弱；采用BoNT/A 重鏈連續(xù)給藥后，同時間點(diǎn)損傷局部頭尾端的熒光強(qiáng)度比單純損傷組更為增強(qiáng)(圖4)。高倍鏡下的熒光特征顯示采用BoNT/A重鏈干預(yù)的動物，脊髓損傷局部p-GAP 43和SCG 10陽性熒光染色不僅分布于細(xì)胞胞漿，同時細(xì)胞突起也呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，由此而使細(xì)胞突起顯而易見。免疫熒光結(jié)果也提示BoNT/A 重鏈干預(yù)的脊髓損傷組織，p-GAP 43和SCG 10局部分布特征相似，皆主要以損傷周邊表達(dá)增強(qiáng)。由于細(xì)胞突起顯而易見，因此，可以認(rèn)為BoNT/A 重鏈干預(yù)脊髓損傷周邊組織內(nèi)神經(jīng)突起的長度和數(shù)目(圖4)。

3 討論

本研究主要通過單側(cè)腰段脊髓損傷基礎(chǔ)上局部和鞘內(nèi)間斷性給予BoNT/A 重鏈，以此觀察BoNT/A重鏈對脊髓損傷局部生長相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BoNT/A 重鏈可干預(yù)脊髓損傷后蛋白表達(dá)，對于選擇性生長相關(guān)蛋白p-GAP 43和SCG 10則具有增強(qiáng)其表達(dá)、增加其在神經(jīng)細(xì)胞及其突起內(nèi)的分布。

與周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)相比，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后通常不能再生[17-18]，其原因主要?dú)w結(jié)于損傷的成熟CNS處于富含抑制蛋白和糖蛋白的抑制環(huán)境。此外，損傷的成熟CNS神經(jīng)元內(nèi)在的生長程序的啟動非常有限[7]。因此，作為CNS之一的脊髓發(fā)生損傷后的再生修復(fù)是非常有限的。大多數(shù)SCI患者面臨著神經(jīng)功能障礙和終身殘疾的問題。因此，通過各種方式激活CNS的內(nèi)在生長程序[19]、或通過提供一個允許的環(huán)境來促進(jìn)CNS的神經(jīng)細(xì)胞或軸突再生,積極探討促進(jìn)脊髓損傷后的再生修復(fù)的策略和方法是再生醫(yī)學(xué)的焦點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)中所采納的BoNT/A重鏈為人工重組的多肽鏈，保留了BoNT/A與宿主細(xì)胞結(jié)合的功能結(jié)構(gòu)。我們前期的體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，將人工重組的BoNT/A 重鏈加入培養(yǎng)的Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)，可促進(jìn)該細(xì)胞神經(jīng)突起增長、突起數(shù)目增多等，具有促神經(jīng)生長的作用[20-21]。因此可以推論在體應(yīng)用BoNT/A重鏈時，只要能夠保持重鏈進(jìn)入體內(nèi)不被分解、維持有效濃度，則可發(fā)揮其在體外類似的促神經(jīng)突起生長作用。本實(shí)驗(yàn)采用損傷當(dāng)時局部給予BoNT/A重鏈及術(shù)后經(jīng)腰骶部插管進(jìn)行鞘內(nèi)間斷性給藥的方法，盡可能保證將BoNT/A重鏈直接導(dǎo)入損傷局部、維持一定藥物濃度，避免其被外周抗體中和單核吞噬細(xì)胞吞噬的結(jié)局，可以保證藥物在實(shí)驗(yàn)觀察階段持續(xù)有效。因此，此種給藥方法適合用于觀察干預(yù)脊髓損傷后再生修復(fù)的一些藥物/制劑的長期療效。

損傷軸突的最終成功再生依賴于再生相關(guān)基因(regeneration-associated genes, RAGs)及其對應(yīng)蛋白質(zhì)在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯合成[22]。研究者曾經(jīng)觀察外周神經(jīng)損傷早期的細(xì)胞體反應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)損傷后所屬神經(jīng)元的mRNA及其相關(guān)蛋白的合成明顯增加，這種反應(yīng)呈現(xiàn)了損傷后的積極主動的再生修復(fù)過程[23-24]，譬如：損傷后軸突特異生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)的表達(dá)上調(diào)被認(rèn)為積極參與軸突再生[25-26]。除GAP-43外，本實(shí)驗(yàn)中所選擇的另一個生長相關(guān)蛋白(頸上神經(jīng)節(jié)蛋白10，SCG 10)亦是參與神經(jīng)軸突再生的主要結(jié)構(gòu)蛋白。GAP-43主要以磷酸化形式參與成熟神經(jīng)軸突發(fā)芽和再生，在神經(jīng)損傷時表達(dá)上調(diào)；而SCG 10，也被稱為STMN蛋白2(STMN2),屬于stathmin家族蛋白，主要參與軸突內(nèi)的微管動力學(xué)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[27-28]，是神經(jīng)軸突再生的標(biāo)志蛋白之一[29]。本研究之所以選擇GAP-43及SCG 10作為BoNT/A重鏈?zhǔn)鞘欠窀深A(yù)脊髓損傷后再生修復(fù)的標(biāo)志蛋白主要是基于上述兩種蛋白的促神經(jīng)生長作用，同時還由于二者的分子量恰好位于雙向電泳結(jié)果中呈現(xiàn)變化的蛋白點(diǎn)水平范圍內(nèi)。針對這兩種選擇性性生長相關(guān)蛋白的SDS-PAGE及Western Blot 結(jié)果顯示：不論p-GAP-43或SCG 10，在單純脊髓損傷時二者的表達(dá)均有所增多；不論二者在損傷后隨時間變化的特征有何差異，損傷基礎(chǔ)上的BoNT/A重鏈應(yīng)用皆可促進(jìn)二者的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：脊髓損傷后的p-GAP 43和SCG 10的表達(dá)增加是脊髓組織對損傷做出的有限再生反應(yīng)，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后局部還有大量的髓磷脂抑制因子的產(chǎn)生及對神經(jīng)軸突再生的抑制作用，因此單純損傷后的p-GAP 43和SCG 10的表達(dá)增加并不能代表神經(jīng)軸突可以進(jìn)行有效再生；BoNT/A 重鏈對p-GAP 43和SCG 10表達(dá)的進(jìn)一步促進(jìn)可以看做是BoNT/A 重鏈在體發(fā)揮干預(yù)作用的一部分。事實(shí)亦是如此，BoNT/A 重鏈對神經(jīng)細(xì)胞的干預(yù)作用并不僅限于干預(yù)生長相關(guān)蛋白的表達(dá)。我們同期的實(shí)驗(yàn)研究已觀察到BoNT/A 重鏈可以抑制髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin associated glycoprotein, MAG)的表達(dá)，并可拮抗MAG促ROCK的磷酸化(另文發(fā)表)。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷：在體脊髓損傷后局部給予BoNT/A重鏈通過其促進(jìn)多種生長相關(guān)蛋白的表達(dá)等最終發(fā)揮其促損傷后神經(jīng)再生修復(fù)的作用。然而，由于本實(shí)驗(yàn)僅僅觀察了BoNT/A重鏈對p-GAP 43 和SCG 10的表達(dá)，其對在體CNS(包括脊髓)損傷后更多參與再生修復(fù)蛋白的影響尚需進(jìn)一步的研究。

[1] Silver J, Miller JH. Regeneration beyond the glial scar [J]. Nat Rev Neurosci, 2004, 5(2): 146-156.

[2] Giger RJ, Hollis ER, Tuszynski MH. Guidance molecules in axon regeneration [J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2010, 2(7): a001867.

[3] Simpson LA, Eng JJ, Hsieh JT, et al. The health and life priorities of individuals with spinal cord injury: A systematic review [J]. J Neurotrauma, 2012, 29(8): 1548-1555.

[4] Ferguson TA, Son YJ. Extrinsic and intrinsic determinants of nerve regeneration [J]. J Tissue Eng, 2011, 2(1): 204173141 1418392.

[5] He Z. Intrinsic control of axon regeneration [J]. J Biomed Res, 2010, 24(1):2-5.

[6] Burgen AS, Dickens F, Zatman LJ. The action of botulinum toxin on the neuro-muscular junction [J]. J Physiol, 1949, 109(1-2): 10-24.

[7] Schiavo G, Rossetto O, Benfenati F, et al. Tetanus and botulinum neurotoxins are zinc proteases specific for components of the neuroexocytosis apparatus [J]. Ann N Y Acad Sci, 1994, 710: 65-75.

[8] Navarrete AL, Rafferty KL, Liu ZJ, et al. Botulinum neurotoxin type A in the masseter muscle: effects on incisor eruption in rabbits [J]. Am J Orthod Dentofacial Orthop, 2013, 143(4): 499-506.

[9] Park SY, Park YW, Ji YJ, et al. Effects of a botulinum toxin type A injection on the masseter muscle: An animal model study [J]. Maxillofac Plast Reconstr Surg, 2015, 37(1): 10.

[10] Ansved T, Odergren T, Borg K. Muscle fiber atrophy in leg muscles after botulinum toxin type A treatment of cervical dystonia [J]. Neurol, 1997, 48(5): 1440-1442.

[11] Durham PL, Cady R, Cady R. Regulation of calcitonin gene-related peptide secretion from trigeminal nerve cells by botulinum toxin type A: implications for migraine therapy [J]. Headache, 2004, 44(1): 35-42.

[12] Schiavo G, Matteoli M, Montecucco C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis [J]. Physiol Rev, 2000, 80(2): 717-766.

[13] Lacy DB, Tepp W, Cohen AC, et al. Crystal structure of botulinum neurotoxin type A and implications for toxicity [J]. Nat Struct Biol, 1998, 5(10): 898-902.

[14] 李夏青．肉毒桿菌毒素的臨床應(yīng)用及其前景[M]. 北京:知識產(chǎn)權(quán)出版社，2012: 1-200．

[15] Ayyar BV, Tajhya RB, Beeton C, et al. Antigenic sites on the HN domain of botulinum neurotoxin A stimulate protective antibody responses against active toxin [J]. Sci Rep, 2015, 5: 15776.

[16] 鄧亞南, 劉艷芳, 陳建平, 等. 經(jīng)大鼠腰骶部鞘內(nèi)置管給藥技術(shù)的研究 [J]. 中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新, 2014, 11(18): 33-35.

[17] Goldberg JL, Klassen MP, Hua Y, et al. Amacrine-signaled loss of intrinsic axon growth ability by retinal ganglion cells [J]. Science, 2002, 296(5574): 1860-1864.

[18] Fernandes KJ, Fan DP, Tsui BJ, et al. Influence of the axotomy to cell body distance in rat rubrospinal and spinal motoneurons: differential regulation of GAP-43, tubulins, and neurofilament-M [J]. J Comp Neurol, 1999, 414(4): 495-510.

[19] Fagoe ND, van Heest J, Verhaagen J. Spinal cord injury and the neuron-intrinsic regeneration-associated gene program [J]. Neuromolecular Med, 2014, 16(4): 799-813.

[20] 高美玲, 王紅, 張彩云, 等. 血清型A肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈對 Neuro-2a 細(xì)胞的促神經(jīng)突起再生作用 [J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(12): 2221-2227.

[21] 王紅, 高美玲, 蘭婧, 等. 小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株用于A 型肉毒毒素重鏈體外實(shí)驗(yàn)的可行性研究 [J]. 中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志:電子版, 2015, 5(4): 23-28.

[22] Ma TC, Willis DE. What makes a RAG regeneration associated? [J]. Front Mol Neurosci, 2015, 8: 43.

[23] Lieberman AR. The axon reaction: a review of the principal features of perikaryal responses to axon injury [J]. Int Rev Neurobiol, 1971, 14: 49-124.

[24] Grafstein B. The nerve cell body response to axotomy [J]. Exp Neurol, 1975, 48 (3 pt.2): 32-51.

[25] Skene JH, Willard M. Axonally transported proteins associated with axon growth in rabbit central and peripheral nervous systems[J]. J Cell Biol, 1981, 89(1): 96-103

[26] Skene JH. Axonal growth-associated proteins [J]. Annu Rev Neurosci, 1989, 12: 127-156.

[27] Ozon S, Maucuer A, Sobel A. The stathmin family — molecular and biological characterization of novel mammalian proteins expressed in the nervous system [J]. Eur J Biochem, 1997, 248(3):794-806.

[28] Wang J, Shan C, Cao W, et al. SCG 10 promotes non-amyloidogenic processing of amyloid precursor protein by facilitating its trafficking to the cell surface [J]. Hum Mol Genet, 2013, 22(24): 4888-4900.

[29] Shin JE, Geisler S, Diantonio A. Dynamic regulation of SCG 10 in regenerating axons after injury [J]. Exp Neurol, 2014, 252(3): 1-11.