金芩芍注射液含量測定的不確定度分析

張璐，龔旭昊，范強

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

在進行獸藥檢驗時，檢驗環(huán)境的變化、儀器的限制、方法的不完善及操作的不規(guī)范等，使檢驗結(jié)果產(chǎn)生誤差。正確表達含有誤差的檢驗結(jié)果及評價檢驗結(jié)果的可信程度，可使檢驗結(jié)果更準(zhǔn)確，檢驗結(jié)論更科學(xué)可靠。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，用來定量表示測量結(jié)果的可信程度[1]。測量不確定度對測量結(jié)果臨界值的判斷、檢測方法的確認(rèn)和測量結(jié)果與國際接軌具有重要意義。試驗根據(jù)CNAS-GL06:2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》及相關(guān)規(guī)定[2]，參考相關(guān)文獻，對高效液相色譜法測定金芩芍注射液含量的不確定度進行評價[3]，探討其在中藥注射劑定量檢驗中的應(yīng)用，提高檢驗結(jié)論的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Waters e2695，2489UV/Vis Detector)；電子天平(METTLER TOLEDO，XS205)；250 mL單標(biāo)線容量瓶(A級)；25 mL單標(biāo)線容量瓶(A級)；5 mL單標(biāo)線移液管(A級)；乙腈(色譜級，默克公司)；0.4%磷酸水溶液：量取4 mL磷酸(批號：20161215，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)置試劑瓶中，加水至1000 mL，搖勻。綠原酸對照品(批號：Z0261702，98.3%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；金芩芍注射液(批號：20160701，規(guī)格：10 mL)。

1.2 色譜條件 色譜柱：XBridgeTMC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸水(13∶87)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm。

1.3 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品12.50 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，加流動相適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.4 供試品溶液的制備 取3支供試品混勻[4]，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.5 數(shù)學(xué)模型 本試驗數(shù)學(xué)模型為：

式中：CX為供試品中綠原酸的濃度；AX為供試品溶液的峰面積；AS為對照品溶液的峰面積；W為對照品的稱樣量(mg)；p為對照品的純度；VS為對照品溶液的體積(mL)；V1為供試品的量取體積(mL)；V2為供試品的定容體積(mL)。

1.6 測定步驟分析及結(jié)果計算模型 在上述條件下，分別測定供試品溶液與對照品溶液，并按公式計算綠原酸含量。具體步驟如圖1。

圖1 金芩芍注射液含量測定試驗步驟Fig 1 Steps of mensuration of the content of Jinqinshao Injection

2 結(jié)果與分析

2.1 測量不確定度主要來源及分析 測量過程中不確定度的來源主要有以下三個方面(圖2)：(1)對照品稱量過程引入的不確定度(W)；(2)供試品溶液、對照品溶液配制過程引入的不確定度(V1/V2、VS)；(3)供試品溶液、對照品溶液峰面積測定引入的不確定度(AX、AS)。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供該批綠原酸對照品的純度為 98.3%，但未提供其不確定度的信息，結(jié)合查閱文獻結(jié)果可知，對照品純度的不確定度對試驗結(jié)果影響可忽略不計，故本文不予評定。

2.2 量化不確定度分量

圖2 測量不確定度來源Fig 2 The source of measurement uncertainty

稱量采用減重法進行，2次讀數(shù)獨立而不相關(guān)，故天平的示值誤差應(yīng)計算2次，所以對照品稱量過程中引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

將上述分量合成得250 mL單標(biāo)線容量瓶標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=2.79×10-1mL

表1 250 mL容量瓶的重復(fù)量取結(jié)果(n=10)Tab 1 The results of repeated measuring of 250 mL volumetric flask(n=10)

將上述分量合成得5mL單標(biāo)線移液管標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=8.89×10-3mL

將上述分量合成得25mL單標(biāo)線容量瓶標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=2.95×10-2mL

表2 5 mL重復(fù)量取結(jié)果(n=10)Tab 2 The results of repeated measuring of 5 mL volumetric flask(n=10)

表3 25 mL容量瓶的重復(fù)量取結(jié)果(n=10)Tab 3 The results of repeated measuring of 25 mL volumetric flask(n=10)

2.2.4 對照品溶液重復(fù)性測試引入的不確定度u(AS) 在測定峰面積時，儀器引入的不確定度如電信號的轉(zhuǎn)換，由于被檢濃度遠遠大于檢測限，可忽略不計。對測量產(chǎn)生的影響體現(xiàn)在重復(fù)性中。取對照品溶液在高效液相色譜儀上連續(xù)測定6次，測定結(jié)果為隨機測量，u(AS)屬于A類不確定度，應(yīng)用貝塞爾公式法計算，數(shù)據(jù)見表4。

表4 綠原酸對照品峰面積的重復(fù)測定結(jié)果(n=6)Tab 4 The results of repeated measuring of chlorogenic acid(n=6)

2.2.5 供試品溶液峰面積的不確定度u(AX) 同2.2.4，取供試品溶液在高效液相色譜儀上連續(xù)測定6次，應(yīng)用貝塞爾公式法計算，數(shù)據(jù)見表5。

表5 供試品峰面積的重復(fù)測定結(jié)果(n=6)Tab 5 The results of repeated measuring of Jinqinshao Injection

2.2.6 計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 u(CX)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度是測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差的估計值，是將所有測量不確定度分量合成為總體方差的正平方根。將上述各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(CX)/CX匯總在表6，計算合成相對不確定度：

測得金芩芍注射液中綠原酸的含量：

=2.96 mg/mL

則合成相對不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(CX)= ucrel(CX)×2.96 mg/mL=0.0075×2.96 mg/mL=0.02 mg/mL

2.2.7 擴展不確定度與測量不確定度報告 擴展不確定度為合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度與包含因子的乘積，U=u(CX)·k=0.02×2=0.04 mg/mL(包含因子k=2，置信區(qū)間為95%)。測量結(jié)果由測定值±擴展不確定度表示[7]。最終結(jié)果可表示為(2.96±0.04)mg/mL，k=2。

3 討 論

試驗采用高效液相色譜法測定金芩芍注射液中綠原酸的含量。根據(jù)CNAS-GL06：2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》及相關(guān)規(guī)定，并參考相關(guān)文獻，對高效液相色譜法測定金芩芍注射液含量的不確定度進行評價。通過比較各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的大小，可發(fā)現(xiàn)對檢測結(jié)果影響程度較大的試驗環(huán)節(jié)，進而重點控制該環(huán)節(jié)的不確定度來源，從而為進一步提高檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性奠定基礎(chǔ)。

試驗中，對照品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為6.71×10-3，屬最大分量；供試品峰面積測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為2.28×10-3，屬第二大分量；供試品取樣體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.78×10-3，屬第三大分量。因而，對于中藥注射劑的定量檢驗中的風(fēng)險環(huán)節(jié)，需重點關(guān)注天平、高效液相色譜儀及移液管的使用和維護。

對具體操作的指導(dǎo)意義有：①對照品的稱量為毫克級，稱量會引起較大的誤差，為減小稱量引入的不確定度，可根據(jù)天平的精度和量程范圍選擇適宜的天平，并根據(jù)所稱樣品的性質(zhì)適當(dāng)增加稱樣量。②應(yīng)加強對高效液相色譜儀的保養(yǎng)，使其保持穩(wěn)定的狀態(tài)；加強試驗過程的控制及標(biāo)準(zhǔn)操作訓(xùn)練，以減少隨機變化和人為因素對試驗結(jié)果的影響。另外應(yīng)盡量確保色譜峰峰面積控制在百萬級內(nèi)。若色譜峰峰面積超過千萬級可能會引入較大的測定誤差。③玻璃量器中體積越小的量器引入的不確定度越大，建議使試驗溫度接近校準(zhǔn)溫度或選用A級大容量量器來降低誤差。

引入測量不確定度后，檢測結(jié)果由單一數(shù)值轉(zhuǎn)變?yōu)楸粶y值可能分布的區(qū)間范圍，通過“檢測值±擴展不確定度(U)”表示，若“檢測值±U”不在限值內(nèi)，則檢測結(jié)果判定為不合格；若在限值內(nèi)，則檢測結(jié)果判定為合格；若橫跨在限值兩側(cè)，則檢測結(jié)果判定存在不確定性，具有一定風(fēng)險，應(yīng)重點關(guān)注?？赏ㄟ^選擇更有經(jīng)驗的檢驗人員重復(fù)檢驗，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]。如反復(fù)檢測驗證后，“檢測值±U”仍橫跨在限值兩側(cè)，比較穩(wěn)妥的辦法是判定為符合規(guī)定的同時給出風(fēng)險提示。

試驗為高效液相色譜法測定中藥注射液有效成分含量不確定度評價提供了可靠的方法，并為提高中藥注射液含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了參考依據(jù)。

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