桉油溶液劑的急性毒性和安全藥理學(xué)研究

陽(yáng)剛，殷中瓊，魏琴，周黎軍，楊仕群

(1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化工工程系，四川宜賓 644003；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院天然藥物研究中心，成都 611130；3.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓 644000)

桉油是從桃金娘科植物藍(lán)桉、樟科植物樟或上述兩種同屬其他植物經(jīng)水蒸氣蒸餾的方法萃取得到的一種揮發(fā)油[1]。研究表明，桉油具有抗菌、鎮(zhèn)痛抗炎以及良好的透皮滲透作用[2-3]。除此以外，桉油對(duì)蠕形螨、蛛形螨、滴蟲和竹斑蛾幼蟲有較強(qiáng)的殺滅和防治作用[4-5]，常作為皮膚滲透增強(qiáng)劑、鼻血管收縮劑，鎮(zhèn)咳劑、空氣消毒劑、殺菌防臭劑、驅(qū)蚊蠅劑等。隨著人們對(duì)藥物殘留、食品安全性、環(huán)境污染等問題的日益重視，研制高效、低毒、安全的天然抗菌、抗寄生蟲藥物用來替代化學(xué)類藥物具有十分重要的意義。前人研究發(fā)現(xiàn)桉油的主要成分1，8-桉油素具有改善豚鼠哮喘，增強(qiáng)補(bǔ)骨脂素體外抗腫瘤活性的作用[6-7]，但目前尚未見桉油溶液劑的急性毒性和安全藥理學(xué)研究報(bào)道。本研究通過桉油溶液劑對(duì)大鼠的急性毒性、神經(jīng)系統(tǒng)、血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)的影響來初步評(píng)價(jià)該藥的安全性和毒性，以期為進(jìn)一步進(jìn)行臨床試驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供藥理毒理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物試劑及儀器 桉油(江西福達(dá)香料化工有限公司)，溶劑(藥典級(jí)，CAS號(hào)：9005-65-6)。桉油溶液劑，由桉油加溶劑制備而成。電子天平(寧波群安儀器有限公司)、多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)、多功能大鼠自主活動(dòng)記錄儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)、BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)。

1.2 動(dòng)物 健康大鼠(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2008-24)，體重(200±20)g，雌雄各半，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 桉油溶液劑急性毒性實(shí)驗(yàn) 將健康大鼠隨機(jī)分為3組，每組4只，雌雄各半。以5742 mg/kg為最高劑量組，再以3倍遞減設(shè)置若干組，依次進(jìn)行試驗(yàn)，找出4/4致死量和0/4致死量，以確定LDn (最低致死劑量)和LDm (最高致死劑量)。

參考獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編和急性毒性試驗(yàn)[8-10]，將大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半，設(shè)5個(gè)劑量組：2772、3267、3960、4752、5742 mg/kg。對(duì)各劑量組進(jìn)行一次性經(jīng)口灌胃給藥，給藥后觀察并記錄大鼠的攝食、飲水、呼吸、活動(dòng)和死亡情況，連續(xù)觀察7 d，若4 d后仍有動(dòng)物死亡，則觀察14 d。用改良寇氏法計(jì)算桉油溶液劑的LD50和95%可信區(qū)間。對(duì)試驗(yàn)期間死亡的和觀察期滿處死的大鼠進(jìn)行剖檢，若發(fā)現(xiàn)異常組織或臟器，作病理組織學(xué)鏡檢。

1.4 桉油溶液劑安全性藥理實(shí)驗(yàn)

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥方法 大鼠按體重隨機(jī)分成5組，包括低劑量組、中劑量組、高劑量組、賦形劑組和空白對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。高劑量(30%)、中劑量(18%)、低劑量(6%)組和賦形劑組分別按0.3 mL/只涂抹桉油溶液劑和賦形劑，對(duì)照組涂抹等劑量生理鹽水[4]。連續(xù)給藥5 d，其中低劑量為治療劑量。

1.4.2 桉油溶液劑對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響 最后一天給藥后4 h內(nèi)，分別密切觀察記錄各組大鼠的一般行為表現(xiàn)、姿勢(shì)、瞳孔變化及步態(tài)等，記錄是否有流涎、肌顫等情況[8-9]。給藥后7 d內(nèi)每日觀察大鼠情況。如出現(xiàn)明顯的中樞興奮、抑制或其他中樞系統(tǒng)反應(yīng)時(shí)，進(jìn)行相應(yīng)的體內(nèi)或體外試驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

通過以下實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。自主活動(dòng)：最后一次給藥0.5 h后，采用多功能大鼠自主活動(dòng)記錄儀，觀察和記錄大鼠的自主活動(dòng)情況。爬桿試驗(yàn)：最后一次給藥后0.5 h后，進(jìn)行大鼠的爬桿試驗(yàn)，將光滑金屬棒垂直豎立，基部固定，將大鼠置于金屬棒頂端，頭朝下讓其自然向下爬行，每只大鼠按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)級(jí)。0級(jí)：一步一步向下爬；1級(jí)：向下滑行；2級(jí)：不能抓住棒；3級(jí)：翻正反射消失。

1.4.3 桉油溶液劑對(duì)大鼠心血管系統(tǒng)的影響 分別于給藥前、給藥結(jié)束次日和給藥結(jié)束一周末，測(cè)定并記錄各組大鼠的心率情況[8-9]。治療劑量出現(xiàn)明顯的心率、節(jié)律異常時(shí)，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的體內(nèi)或體外試驗(yàn)的進(jìn)一步研究。心率的測(cè)定方法：大鼠用戊巴比妥鈉按50 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉，待其麻醉后，使用BL-420F記錄心電圖，心率。

1.4.4 桉油溶液劑對(duì)大鼠呼吸系統(tǒng)的影響 分別于給藥前、給藥結(jié)束次日和給藥結(jié)束一周末，測(cè)定并記錄各組大鼠呼吸頻率，并觀察比較其呼吸節(jié)律和呼吸深度等[8-9]。治療劑量出現(xiàn)明顯的呼吸興奮或抑制時(shí)，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的體內(nèi)或體外試驗(yàn)的進(jìn)一步研究。呼吸頻率的測(cè)定方法是，大鼠用戊巴比妥鈉按50 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉，待其麻醉后，使用BL-420F記錄大鼠呼吸頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉油溶液劑急性毒性實(shí)驗(yàn) 各劑量給藥組大白鼠的臨床表現(xiàn)、大體剖檢結(jié)果及心、肝、肺、腎、胃和腸的器官組織觀察結(jié)果表明：低劑量組無(wú)明顯變化，高劑量時(shí)造成胃鼓氣或者胃內(nèi)容物不消化，有桉油水乳劑殘留現(xiàn)象，其他臟器無(wú)肉眼可見病變。死亡情況見表1。

表1 桉油溶液劑對(duì)大鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Effects of eucalyptus oil solution in acute oral toxicity test in rats

大鼠(每組10只)灌胃2772、3267、3960、4752、5742 mg/kg的桉油溶液劑后觀察7 d

Rats were given 2772 mg/kg、3267 mg/kg、3960 mg/kg、4752 mg/kg、5742 mg/kg doses of eucalyptus oil solution by intragastric administration with a 7-day medical observation.n=10

由表1可知 i=lgdn-lgdn-1=lgd5-lgd4=3.7591-3.6769=0.0822，將表中數(shù)據(jù)代入改良寇氏法公式進(jìn)行計(jì)算，LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]=lg-1[3.7591-0.0822(2.7-0.5)]=lg-1(3.57826)=3811.5 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)誤差 Sx50=i×[(∑p-∑P2)/n-1]1/2=0.0822×[(2.7-1.91)/9]1/2=0.024，LD50的95%可信限= lg-1(X50±1.96 Sx50)=lg-1(lg3811.5±1.96×0.024)，X50=lgLD50，lg-1(2.548)=3326.4 mg/kg，lg-1(4.259)=4306.5 mg/kg，可以得出 LD50為3811.5 mg/kg±0.047 mg/kg，95%置信區(qū)間3326.4 ～4306.5 mg/kg。

2.2 桉油溶液劑安全性藥理實(shí)驗(yàn)

2.2.1 桉油溶液劑大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響 在為期2周的試驗(yàn)過程中，3個(gè)受試藥物組和賦形劑組大鼠的行為表現(xiàn)、姿勢(shì)、步態(tài)以及瞳孔變化在整個(gè)試驗(yàn)過程中均未見異常，也未見流涎、肌顫等異樣。用藥組和爬桿實(shí)驗(yàn)中均一步一步向下爬，評(píng)價(jià)為0級(jí)。賦形劑組大鼠的活動(dòng)靈活自如，與對(duì)照組無(wú)明顯差異，被毛的光亮度肉眼觀察與對(duì)照組也無(wú)差異。表明桉油溶液劑對(duì)大鼠的中樞系統(tǒng)無(wú)明顯不良影響。

2.2.2 桉油溶液劑大鼠心率的影響 通過測(cè)定給藥前后各組大鼠的心率發(fā)現(xiàn)，高、中、低、賦形劑和空白對(duì)照5個(gè)組在給藥前、給藥結(jié)束次日以及給藥后1周末大鼠的心率與同期對(duì)照組間均無(wú)明顯差異(P>0.05)，且同組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間也無(wú)顯著差異(P>0.05)。初步表明桉油溶液劑對(duì)大鼠的心血管系統(tǒng)無(wú)明顯不良影響，結(jié)果見表2。給藥前后各劑量組大鼠的心電圖見圖1～圖10，由圖可知，桉油溶液劑各劑量對(duì)大鼠的心率無(wú)影響。

表2 大鼠不同時(shí)間的心率Tab 2 The heart rates in rats in different time

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05差異顯著,**P<0.01差異極顯著，n=10

*P<0.05,**P<0.01, compared with normal control group

圖1 給藥前空白組大鼠心電圖Fig 1 Electrocardiograms in normal control group before treatment

圖2 給藥后空白組大鼠心電圖Fig 2 Electrocardiograms in normal control group at the day after treatment

圖3 給藥前賦形劑組大鼠心電圖Fig 3 Electrocardiograms in vehicle control group before treatment

圖4 給藥后賦形劑組大鼠心電圖Fig 4 Electrocardiograms in vehicle control group at the day after treatment

圖5 給藥前低劑量桉油溶液劑組(6%)大鼠心電圖Fig 5 Electrocardiograms with low dose group of eucalyptus oil solution(6%)before treatment

圖6 給藥后低劑量桉油溶液劑組(6%)大鼠心電圖Fig 6 Electrocardiograms with low dose group of eucalyptus oil solution(6%)at the day after treatment

圖7 給藥前中劑量桉油溶液劑組(18%)大鼠心電圖Fig 7 Electrocardiograms with middle dose group of eucalyptus oil solution(18%)before treatment

圖8 給藥后中劑量桉油溶液劑組(18%)大鼠心電圖Fig 8 Electrocardiograms with middle dose group of eucalyptus oil solution(18%)at the day after treatment

圖9 給藥前高劑量桉油溶液劑組(30%)大鼠心電圖Fig 9 Electrocardiograms with high dose group of eucalyptus oil solution(30%)before treatment

圖10 給藥后高劑量桉油溶液劑組(30%)大鼠心電圖Fig 10 Electrocardiograms with high dose group of eucalyptus oil solution(30%)at the day after treatment

2.2.3 桉油溶液劑大鼠呼吸系統(tǒng)的影響 通過測(cè)定給藥前后各組大鼠的呼吸頻率發(fā)現(xiàn)，高、中、低、賦形劑和空白對(duì)照5個(gè)給組在給藥前、給藥結(jié)束次日以及給藥后1周末，大鼠的呼吸頻率與同期對(duì)照

組間均無(wú)明顯差異(P>0.05)，且同組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間也無(wú)顯著差異(P>0.05)。表明桉油溶液劑對(duì)大鼠的呼吸系統(tǒng)無(wú)明顯不良影響，結(jié)果見表3。

表3 大鼠不同時(shí)間的呼吸頻率Tab 3 The breathing rates in rats in different time

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05差異顯著, **P<0.01差異極顯著，n=10

*P<0.05, **P<0.01, compared with normal control group.

3 討論與小結(jié)

桉油的有效成分主要以1，8-桉油素為主， 用于治療感冒、細(xì)菌性痢疾、腸炎及寄生蟲病，但目前， 桉油在用于動(dòng)物疾病的防治方面的研究較少[11]。為了制備穩(wěn)定、低毒、方便的桉油制劑，篩選適宜溶劑，成功制備桉油溶液劑，對(duì)桉油溶液劑的急性毒性和安全藥理學(xué)進(jìn)行了試驗(yàn)。急性毒性試驗(yàn)是藥物毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)的第一步，具有了解受試物急性毒性強(qiáng)弱的作用[12]。LD50是檢測(cè)物質(zhì)急性毒性的經(jīng)典指標(biāo)，穩(wěn)定性好，敏感度高[13]。在大鼠口服急性毒性試驗(yàn)中，按照改良寇氏法計(jì)算出LD50為3811.5 mg/kg；余永莉等[14]研究結(jié)果表明，桉葉油小鼠口服給藥LD50為1824.01 mg/kg，對(duì)比二者LD50，可發(fā)現(xiàn)桉油溶液劑的半數(shù)致死量約為桉葉油的兩倍，考慮桉油溶液劑和桉葉油有效藥物濃度不同，說明桉油溶液劑與桉葉油比較毒性未明顯增強(qiáng)。根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判斷[15]，桉油溶液劑口服給藥屬低毒性藥物。

安全性藥理學(xué)評(píng)價(jià)是指主要藥效作用以外廣泛藥理作用研究，尤其是觀察藥物對(duì)呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)的影響，補(bǔ)充毒性試驗(yàn)觀察的不足，為全面了解藥物的毒性提供基礎(chǔ)，為臨床提供更多的信息[16]。因此，安全性藥理學(xué)評(píng)價(jià)有助于發(fā)現(xiàn)藥物不良反應(yīng)，也有助于發(fā)現(xiàn)藥物的新用途和作用機(jī)制[17]。本試驗(yàn)按照獸用中藥、天然藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則，首次通過無(wú)創(chuàng)的方式測(cè)定了桉油溶液劑對(duì)有維持生命作用的三大重要系統(tǒng)的影響。

觀察桉油溶液劑對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，可有多種檢測(cè)項(xiàng)目，如動(dòng)物的自主活動(dòng)、爬桿試驗(yàn)等[18]。朱海等[19]在研究歐前胡素時(shí)，檢測(cè)了小鼠的自發(fā)活動(dòng)、爬桿能力，并進(jìn)行了小鼠閾下劑量戊巴比妥鈉催眠協(xié)同實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)此藥單次ig對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)明顯影響。車愛萍等[20]研究表明，HR0905藥物可使小鼠爬桿能力顯著下降，自發(fā)活動(dòng)有下降趨勢(shì)，結(jié)果顯示該藥物存在中樞抑制性作用，這也說明對(duì)動(dòng)物進(jìn)行自主活動(dòng)觀察及爬桿試驗(yàn)檢測(cè)，即可反映出藥物對(duì)動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。本試驗(yàn)也采取了這兩種檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠給藥后活動(dòng)自如，爬桿試驗(yàn)中也表現(xiàn)為一步一步向下爬，說明桉油溶液劑對(duì)大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)影響。

對(duì)于心血管系統(tǒng)的檢測(cè)，心電圖和心率等均是可靠而有價(jià)值的觀察指標(biāo)，心電圖異?？煞从承难芟到y(tǒng)發(fā)生不良反應(yīng)，具有重要的臨床指導(dǎo)意義[18]。朱梅等[21]在研究中藥藤菔降壓片一般藥理學(xué)作用時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)麻醉大鼠心率、Q-T間期、P-R間期和QRS波群時(shí)間等均無(wú)明顯影響。由于麻醉程度、保定體位及測(cè)量時(shí)間不同等，均可引起心電圖的變化[18]，所以本試驗(yàn)在盡量減少外界條件對(duì)結(jié)果造成影響的情況下，測(cè)量出給藥組和對(duì)照組各階段的心電圖雖有微小的差異，但均為正常大鼠心電圖。且各給藥組大鼠的心率變化與對(duì)照組亦無(wú)明顯差異，說明桉油溶液劑對(duì)大鼠心血管系統(tǒng)無(wú)影響。

對(duì)于呼吸系統(tǒng)的檢測(cè)，一般檢測(cè)大鼠的呼吸頻率變化[18]。本試驗(yàn)用BL-420多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)，通過大鼠肌張力的強(qiáng)弱來測(cè)量大鼠的呼吸頻率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桉油溶液劑對(duì)大鼠呼吸系統(tǒng)無(wú)明顯影響。以上試驗(yàn)對(duì)桉油溶液劑急性毒性和安全藥理學(xué)進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)， 為進(jìn)一步進(jìn)行臨床治療試驗(yàn)提供了藥理毒理學(xué)基本依據(jù)。

桉油系中國(guó)藥典(2000年版)法定藥材[22]。桉油在醫(yī)學(xué)、 獸醫(yī)臨床均具有應(yīng)用基礎(chǔ)。丁孝良等[23]研究表明，桉油β -環(huán)糊精包合物具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用，可促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成并抑制其分解，其作用機(jī)理可能與抑制iNOS的表達(dá)，降低NO含量有關(guān)。王文婷等[24]研究表明，桉油可提高光動(dòng)力療法治療尖銳濕疣的療效，這是因?yàn)殍裼途哂写贊B作用，可滲入藥物透皮吸收的限速層-角質(zhì)層，降低細(xì)胞間脂質(zhì)排列的有序性，增加流動(dòng)性，從而促進(jìn)藥物透過皮膚。目前關(guān)于桉油藥理毒理基礎(chǔ)的系統(tǒng)性研究鮮有資料報(bào)道，因此，在開發(fā)桉油相關(guān)制劑的同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)桉油藥理毒理學(xué)基礎(chǔ)研究，從而為臨床應(yīng)用提供更為全面的科學(xué)依據(jù)。

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