重組禽流感病毒H5亞型Re-7株在MDCK細胞上增殖條件的研究

陳宏，王博，趙海源*，李金祥，趙博，李莉,王玉紅，崔凱，朱長動

(1.吉林冠界生物技術(shù)有限公司，吉林梅河口 135000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京 100081)

在禽流感病毒中，部分H5和H7亞型毒株可引起高致病性禽流感。我國是世界上禽類養(yǎng)殖量最大的國家，也是高致病性禽流感的爆發(fā)區(qū)，2015年中國大陸10個省發(fā)生16起H5高致病性禽流感疫情，造成的直接經(jīng)濟損失高達數(shù)十億元[1]。這就需要大量安全、高效、低成本的禽流感疫苗。目前市場上大部分疫苗仍為雞胚制備[2]，這種疫苗生產(chǎn)需要消耗大量的SPF雞胚，且勞動強度大、產(chǎn)量不穩(wěn)定，不利于應(yīng)對大規(guī)模的禽流感疫情爆發(fā)。與傳統(tǒng)雞胚生產(chǎn)方法相比，動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感疫苗具有很多優(yōu)勢，如抗原匹配性好，可以進行大規(guī)模生產(chǎn)和縮短生產(chǎn)周期，自動化控制程度高，批間差異小等。通過我們的研究證明，禽流感病毒在MDCK傳代細胞上具有良好的適應(yīng)性，用其培養(yǎng)的禽流感病毒獲得的病毒滴度較高。試驗對H5亞型Re-7株病毒在MDCK細胞中的增殖條件進行探索，以期篩選出最適接毒量和最佳收獲時間，為動物細胞生產(chǎn)禽流感疫苗提供了相對穩(wěn)定的參數(shù)指標。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒 MDCK懸浮細胞系是由吉林冠界生物技術(shù)公司自行馴化；重組禽流感病毒H5亞型Re-7株購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑及耗材 選用培養(yǎng)基為國產(chǎn)無血清全懸浮細胞培養(yǎng)基；1%雞紅細胞懸液由吉林冠界生物技術(shù)公司自行制備；檢驗用SPF雞胚購自梅里亞公司。

1.3 方法

1.3.1 最適接毒量MOI以及最佳收毒時間的確定

將重組禽流感病毒H5亞型Re-7株種毒以不同的MOI(10-3、10-2、10-1)分別接種于3臺100 L生物反應(yīng)器(分別命名為1#、2#、3#反應(yīng)器)相同數(shù)量的細胞中，從接毒后的24 h開始，每隔12 h取樣測其毒價(HA滴度、TCID50以及EID50)直至收毒并測其毒價(HA滴度、TCID50以及EID50)。

1.3.2 禽流感病毒在反應(yīng)器中的接種及增殖過程

接種前將3臺100 L反應(yīng)器的細胞密度都控制在4×106cells/mL左右，細胞活力控制在95%左右，然后通過無菌的方法將MOI為10-3、10-2、10-1的種毒分別接種至1#、2#、3#反應(yīng)器的細胞懸液中。從接毒后24 h開始，每隔12 h取樣監(jiān)測活細胞數(shù)以及細胞活率，并使用顯微鏡觀察細胞病變情況。

2 結(jié) 果

2.1 最適接毒量MOI以及最佳收獲時間

2.1.1 不同的感染復(fù)數(shù)(最適接毒量)對病毒增殖的影響 當(dāng)種毒接入量MOI為10-3時，由于病毒感染量低而使增殖速度降低，無法達到較高的血凝價和毒價。當(dāng)種毒接入量MOI為10-1時，由于病毒的感染量過高而使感染過快，造成細胞在感染的初期過早的死亡，此時也無法獲得較高的血凝價和毒價。而當(dāng)種毒接入量MOI為10-2時病毒的增殖比較穩(wěn)定，病毒的血凝價和毒價較高，血凝價最高值為1∶1024[3]，每1 mL病毒含量最高達到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量最高達到106.83EID50[4]，結(jié)果見表1。

2.2.2 最佳收獲時間的確定 通過對不同感染復(fù)數(shù)對病毒增殖的研究，確定最適接毒量MOI為10-2，在此接毒量的條件下對最佳收獲時間進行試驗分析，當(dāng)接毒后60 h血凝價達到1∶1024，每1 mL病毒含量最高達到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量最高達到106.83EID50，并且在接毒后72 h毒價穩(wěn)定在此水平無明顯變化，說明在接毒后60 h為最佳收獲時間，結(jié)果見圖1。

表1 不同的MOI對病毒增殖的影響(HA、TCID50/mL；EID50/0.1mL)Tab 1 Effects of different MOI on viral proliferation(HA、TCID50/mL, EID50/0.1mL)

圖1 最佳收獲時間曲線Fig 1 The best harvest time curve

2.2 禽流感病毒在反應(yīng)器中的接種及增殖過程

2.2.1 接毒后的活細胞數(shù)以及細胞活力 接毒后隨著時間的推移，病毒的感染逐步增強，活細胞數(shù)會隨之減少，細胞活率逐漸下降。當(dāng)種毒接入量MOI為10-3時，由于病毒感染量低細胞活率下降較慢，病毒的增殖會受影響。當(dāng)種毒接入量MOI為10-1時，由于病毒的感染量過高而使感染過快造成細胞快速死亡，細胞活率下降較快，病毒的增殖也會受到影響。而當(dāng)種毒接入量MOI為10-2時病毒的增殖比較穩(wěn)定，細胞活率下降的趨勢也較為正常，后期收毒時也能保持較高的毒價[5]，結(jié)果見表2。

表2 不同接毒量對接毒后的活細胞數(shù)和細胞活力的影響(cells/mL；%)Tab 2 Effects of the number of living cells and cell viability of different venomous antivirus (cells/mL, %)

2.2.2 接毒后病毒的增殖以及在細胞上的病變情況 當(dāng)種毒接入量MOI為10-2時病毒的增殖比較穩(wěn)定，細胞活率下降的趨勢也較為正常，通過接毒后取樣鏡檢觀察細胞病變情況可以看出，24 h細胞病變開始出現(xiàn)，有部分細胞表面變得粗糙并伴有裂痕。48 h病變十分明顯，部分細胞破裂，說明此時病毒出芽釋放比較明顯。72 h細胞破碎嚴重，病毒出芽釋放相對完全。結(jié)合接毒后48 h～72 h的測毒情況，設(shè)定在接毒后60 h的收獲時間是合理的[6]，結(jié)果見圖2。

A. 健康細胞(400×)A. healthy cells (400×)

B. 24h細胞病變(400×)B. 24h cell lesion (400×)

C. 48h細胞病變(200×)C. 48h cell lesion (200×)

D. 72h細胞病變(200×)D. 72h cell lesion (200×)

3 討 論

利用動物傳代細胞生產(chǎn)禽流感疫苗與使用雞胚苗相比，在產(chǎn)量及疫苗的穩(wěn)定性上都有較為明顯的優(yōu)勢，也在很大程度上降低了由于流感病毒在雞胚上連續(xù)傳代而引起HA基因發(fā)生突變的幾率[7]，使免疫效果更為可靠。隨著MDCK細胞生產(chǎn)禽流感疫苗推向市場，此疫苗的可靠性也在全國范圍內(nèi)得到了更多的認可。

本試驗中重組禽流感病毒H5亞型Re-7株接種MDCK細胞，選取了三種不同的接毒量并在接毒后不同時間取樣監(jiān)測毒價，從而最終確定最適接毒量和最佳收毒時間。在病毒感染復(fù)數(shù)MOI為10-2時收獲時毒價最高，適當(dāng)?shù)牟《窘臃N量可以更好的實現(xiàn)病毒的增殖[8]。當(dāng)接種量過低和細胞數(shù)量不匹配，病毒需要經(jīng)過多次循環(huán)復(fù)制，達到血凝滴度的峰值的時間延長，病毒生產(chǎn)過程減慢，最終的毒價也不高[9]。當(dāng)病毒接種量過多時，細胞在病毒的感染下很快死亡，同時會產(chǎn)生大量不具有感染性的不完全病毒顆粒，限制病毒的多循環(huán)感染[10]。

收毒時間對于病毒培養(yǎng)過程來說也是一個關(guān)鍵性的參數(shù)，試驗在確定接毒量的同時對于收毒時間也進行了研究，在接毒后60 h毒價達到峰值，并且在接毒后72 h毒價仍穩(wěn)定在此峰值水平，沒有明顯的升高或降低，出于對整個工藝流程中時間成本的考慮，收獲的最佳時間應(yīng)為接毒后60 h左右。

利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)動物細胞進行禽流感疫苗生產(chǎn)的技術(shù)已日趨成熟，此種技術(shù)在國內(nèi)外動保行業(yè)正在被廣泛推廣[11]。目前我們的生物反應(yīng)器規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)水平已經(jīng)達到能夠放大至6000 L自動控制的規(guī)模。試驗對重組禽流感病毒H5亞型Re-7株的最適接毒量和最佳收毒時間進行了研究，確定最適接毒量MOI為10-2、最佳收獲時間為60 h，在100 L生物反應(yīng)器中重復(fù)驗證，獲得穩(wěn)定的試驗結(jié)果，病毒血凝價達到1∶1024，每1 mL病毒含量達到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量達到106.83EID50。研究為禽流感疫苗的生物反應(yīng)器的規(guī)?；a(chǎn)提供了可靠的理論依據(jù)。

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