IP-10作為牛結(jié)核病診斷標志物的初步探究

高新桃，賈紅，楊宏軍，朱良全，郭曉宇，侯邵華，袁維峰， 朱鴻飛，鑫婷，丁家波*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心，濟南 250183)

牛結(jié)核病(Bovine Tuberculosis)是一種主要由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis comples, MTBC)成員—牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)感染引起的一種人獸共患慢性傳染病[1-2]。目前世界范圍內(nèi)的牛結(jié)核病疫情形勢嚴峻，約有 5000 萬頭牛感染了結(jié)核病，造成的經(jīng)濟損失每年達 30 多億美元，野生動物帶菌狀況更是無法精確統(tǒng)計[3]，我國牛結(jié)核病流行數(shù)據(jù)主要來自于零星報道：2009～2014年青海23個縣市奶牛結(jié)核病平均陽性率0.06%，耗牛陽性率為0.05%[4]；山東省2010～2012年牛結(jié)核病陽性率分別為29.34%、27.96%和14.93%[5]；個別奶牛場結(jié)核病的陽性率為10.18%[6]，牛結(jié)核病給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失和貿(mào)易限制。該病能傳染給人，嚴重威脅人類健康。據(jù)調(diào)查，2003 年結(jié)核病患者中約有3.4%是由牛分枝桿菌感染引起的，2011 年則上升至 5.4%，在墨西哥，有38%的結(jié)核病患兒是由牛分枝桿菌感染引起[7]。因此，牛結(jié)核病的有效檢測和防控直接關(guān)系著公共衛(wèi)生安全。目前，世界上對牛結(jié)核病的診斷主要依賴于結(jié)核菌素皮試試驗，新西蘭、美國、澳大利亞等發(fā)達國家也將IFN-γ釋放試驗推薦作為牛結(jié)核病的診斷方法。科研工作者仍在不斷開發(fā)新的診斷方法和診斷試劑盒，以期進一步提高牛結(jié)核病診斷方法的靈敏度和特異性，降低檢測成本，簡化檢測步驟，建立更加符合基層和檢疫部門不同需求的牛結(jié)核病診斷方法。

在人結(jié)核病診斷方法的研究中發(fā)現(xiàn)，IP-10、IL-12和TNF-α等細胞因子與結(jié)核病的感染相關(guān)，并有作為結(jié)核病分子標志物的潛力，本研究主要通過采集并分離田間篩選的結(jié)核病陽性牛、陰性牛和牛分枝桿菌人工感染牛的外周血淋巴細胞，利用PPDB、CE、MPT63等抗原刺激后，Real-Time PCR檢測IL-12p40、IP-10、IFN-γ和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平，初步評價上述細胞因子與牛結(jié)核病的相關(guān)性，并用建立的real-time PCR檢測方法檢測14頭結(jié)核病陽性牛，初步評價其對牛結(jié)核病的檢出效果，從而為進一步篩選牛結(jié)核病診斷標識提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 牛分枝桿菌強毒參考株68002(CVCC68002)來自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。M-LV，Oligo dT(15)購自Promega公司；TRIZOL購于Invitrogen公司；dNTP、RI購自TAKARA公司； RPMI1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；48孔細胞培養(yǎng)板購自Corning公司；牛淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；Taqman熒光定量試劑盒購自ABI公司；IFN-γ 釋放試驗用PPDA(Prionics AG)、PPDB(Prionics AG)和BovigamTM購自北京測迪公司；皮試用PPDB、PPDA購買自哈爾濱第六生物制品廠；重組蛋白CFP-10/ESAT-6/TB10.4(CET，0.5 mg/mL)、pET-32a載體標簽蛋白PET(20 μg/mL)、CFP-10-ESAT-6(CE，20 μg/mL)和MPT63(20 μg/mL)由實驗室制備并保存。

1.2 方法

1.2.1 皮試試驗 結(jié)核菌素皮試試驗(Tuberculin Skin Test, TST)根據(jù)國家標準《動物結(jié)核病診斷技術(shù)》(GB/T 18645-2002)進行操作其判定標準為：PPD-B為檢測原時，局部有炎性反應(yīng)，皮厚差≥4 mm為陽性反應(yīng)；無炎性反應(yīng)，皮厚差<2 mm為陰性反應(yīng)；局部炎性反應(yīng)不明顯，2≤皮厚差<4 mm需在檢測結(jié)束后兩個月后進行復(fù)檢，第二次檢測皮厚差≥2 mm，則判定為結(jié)核病陽性。

基于重組蛋白CFP-10/ESAT-6/TB10.4的皮試試驗(CFP-10/ESAT-6/TB10.4-based skin test, CET-based ST)為實驗室建立。該方法操作步驟為在牛頸部一側(cè)皮內(nèi)注射0.1 mL，分別在注射前和注射后72 h由同一操作人員，用游標卡尺測量注射部位皮膚厚度，其判定標準為：皮厚差≥1.1 mm為結(jié)核病陽性，皮厚差<1.1 mm為結(jié)核病陰性。

1.2.2 IFN-γ釋放試驗 采集實驗動物全血置于10 mL肝素鋰抗凝采血管中，分裝至48孔細胞培養(yǎng)板中(750 μL/孔，5孔/份樣品)，無菌條件下分別加入50 μL的PPD-B、PPD-A、PBS、CE、MPT63和PET，輕輕混勻后于37 ℃培養(yǎng)24 h。6000 r/min離心，收集上清，按照BovigamTM試劑盒說明書進行檢測，不同刺激原的OD450nm值分別記作ODPPDB、ODPPDA、ODPBS、ODCE、ODMPT63和ODPET。結(jié)果判定：PPDB/PPDA作為刺激原時(Interferon Gama Release Assay, IGRA)，ODPPDB-ODPPDA<0.1，或ODPPDB-ODPBS<0.1，判為陰性；ODPPDB-ODPPDA≥0.1且ODPPDB-ODPBS≥0.1判定為牛結(jié)核病陽性。重組蛋白CE作為刺激原時(CE-based IGRA)， ODCE-ODPBS≥0.1判定為陽性；ODCE-ODPBS<0.1，判為陰性。ODCE-ODPBS≥0.1判斷為陽性。

1.2.3 牛外周血淋巴細胞的分離及刺激 經(jīng)頸靜脈采集全血放于肝素鋰抗凝采血管中，參照灝洋生物公司牛淋巴細胞分離液說明書操作，分離外周血淋巴細胞(PBLC)，加入1 mL紅細胞裂解液，輕輕吹懸后，靜置3 min，加入10 mL 含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1000 r/min離心5 min，傾去培養(yǎng)基，再用PBS洗滌2次細胞。用2 mL含10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基重懸PBLC，以2×106cell/mL濃度鋪于48孔細胞培養(yǎng)板中(200 μL/孔，6孔/份樣品)。分別向各個孔中加入50 μL的PPDB、PPDA、PBS、CE、M6PT63和 PET，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，每孔分別加入750 μL TRIZOL，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Real-Time PCR 按照TRIZOL說明書提取細胞總RNA。提取后用50 μL DEPC水60 ℃溶解10 min；加入RNA酶抑制劑(RI，1 uL/管)，分光光度計定量后，參照TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成cDNA,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

以cDNA為模板，β-actin基因為內(nèi)參，使用TaqMan Real-Time PCR Master Mix(ABI)試劑盒檢測牛PBLC中IFN-γ、IL-12p40、IP-10和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。每頭牛PBS刺激孔樣品為空白參照，每個樣品作3個重復(fù)孔，用ΔΔCT法分析試驗數(shù)據(jù)。

1.2.5 田間篩選結(jié)核病陽性牛和結(jié)核病陰性牛 通過TST、IGRA、CET-based ST 和CE-based IGRA從結(jié)核病流行牛場篩選10頭結(jié)核病陽性牛，從連續(xù)五年沒有檢測到結(jié)核病的牛場中篩選5頭結(jié)核病陰性牛，分別采集外周血，放于肝素鋰抗凝采血管，無菌分離PBLC分裝于48孔細胞培養(yǎng)板，并用PPDB、PET、CE、MPT63和PBS刺激6 h，收獲細胞后，提取總RNA，Real-Time PCR檢測IFN-γ、IL-12p40、IP-10和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以初步評價細胞因子轉(zhuǎn)錄水平與牛結(jié)核病的相關(guān)性，并篩選有潛力用于牛結(jié)核病診斷的細胞因子。

1.2.6 人工感染牛驗證分子標識

1.2.6.1M.bovis68002的復(fù)蘇及制備 將強毒株M.bovis68002凍干粉充分溶解于2 mL無菌水中，取100 μL接種到7H10固體培養(yǎng)基斜面，4 w后，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接7H9液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min連續(xù)培養(yǎng)14～21 d。收獲菌液，3000 r/min離心15 min，收集菌體沉淀并稱重，用7H9培養(yǎng)液重懸至濃度為400 mg/mL，混勻后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.2 人工攻毒 在連續(xù)五年沒有檢測到結(jié)核病的牛場，用TST、IGRA、CET-based ST 和CE-based IGRA篩選6頭1～2月齡結(jié)核病陰性犢公牛。將6頭牛隨機分成兩組，其中3頭牛靜脈注射2 mLM.bovis68002菌液，另外3頭靜脈注射2 mL PBS生理鹽水作為空白對照。于感染后20 w利用IGRA、CE-based IGRA檢測動物的感染情況。分別于感染前和感染后30 w，采集全血，置于肝素鋰抗凝采血管，無菌分離PBLC分裝于48孔細胞培養(yǎng)板，并用PPDB、PET、CE和PBS刺激6 h，收獲細胞后，提取總RNA，Real-Time PCR檢測IFN-γ和IP-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以進一步確認IFN-γ和IP-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與牛分枝桿菌感染之間的相關(guān)性。

1.2.7 牛結(jié)核病IFN-γ和IP-10 Real-Time PCR檢測方法在臨床上的初步應(yīng)用 通過TST、IGRA、CET-based ST 和CE-based IGRA從結(jié)核病流行牛場篩選10頭結(jié)核病陽性牛，從連續(xù)五年沒有檢測到結(jié)核病的牛場中篩選6頭結(jié)核病陰性牛，分別采集外周血，放于肝素鋰抗凝采血管，提取PBLC分裝于48孔細胞培養(yǎng)板，分別用PPDB、CE和PBS刺激6 h，收獲細胞并提取總RNA，利用建立的牛結(jié)核病IFN-γ和IP-10 Real-Time PCR檢測方法進行檢測，初步評價其對牛結(jié)核病檢出效果。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 將1.6.1數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 6軟件作ROC分析，獲得各細胞因子檢測方法的cutoff值；用ANOVA Kruskal-Wallis檢驗分析組間差異；用Spearman檢驗分析組間相關(guān)性；P<0.05時，判定為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮試試驗和IFN-γ釋放試驗篩選結(jié)核病陽性牛和結(jié)核病陰性牛 通過TST、IGRA、CET-based ST 和CE-based IGRA篩選結(jié)核病陽性牛10頭和結(jié)核病陰性牛5頭(圖1)。結(jié)果表明以PPDB、PPDA、PET、PBS、CE和MPT63分別為刺激原刺激全血時，結(jié)核病陰性牛全血經(jīng)上述抗原刺激后，其IFN-γ水平保持穩(wěn)定，而結(jié)核病陽性牛全血經(jīng)PPDB、PPDA、CE刺激后，其IFN-γ水平顯著高于PET、PBS和MPT63刺激，且顯著高于結(jié)核病陰性牛。因此，MPT63可能并不適于作為牛結(jié)核病IFN-γ釋放試驗的刺激原。

A：結(jié)核菌素皮試試驗及基于重組蛋白CET的皮試試驗；B：IFN-γ釋放試驗圖1 皮試試驗及IFN-γ釋放試驗檢測結(jié)果Fig 1 Results of skin test and Interferon gamma release assay

2.2 牛結(jié)核病細胞因子診斷標識的初步篩選 以PPDB、PPDA、PBS、PET、CE和MPT63分別對牛PBLC進行刺激，以β-actin基因為內(nèi)參，進行Real-Time PCR，檢測IFN-γ、IL-12p40、IP-10和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以每頭牛的PBS刺激孔樣品為參照，用ΔΔCT法分析試驗數(shù)據(jù)，檢測結(jié)果如圖2。結(jié)果顯示PET不能刺激陽性牛PBLC中IFN-γ、IL-12p40、IP-10和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平提高，所以重組蛋白CE和MPT63中標簽蛋白的作用可以忽略不計。MPT63刺激后，結(jié)核病陽性牛和陰性牛的IFN-γ、IL-12p40、IP-10和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平并無顯著性差異，這也與2.1中的結(jié)果吻合。因此，MPT63不適于作為刺激原。

圖2 細胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig 2 The mRNA transcription levels of Cytokines

PPDB、PPDA和CE作為刺激原時，其誘導(dǎo)結(jié)核病陽性牛PBLC產(chǎn)生的IFN-γ、IP-10和TNF-α顯著高于結(jié)核病陰性牛，由于致病性分枝桿菌和環(huán)境分枝桿菌存在交叉抗原，因此以PPDB作為刺激原檢測細胞因子時，需要同時以PPDA作為對照。CE僅存在于致病性分枝桿菌群中，能夠特異性地刺激結(jié)核病陽性牛PBLC產(chǎn)生IFN-γ、IP-10、TNF-α，因此選擇CE刺激后牛PBLC樣品用Spearman檢驗分析細胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平之間相關(guān)性。結(jié)果顯示在CE刺激PBLC后， IFN-γ與IL-12p40、IP-10和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.47、0.65和0.88，雖然TNF-α與IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平之間相關(guān)性最好，但TNF-α在結(jié)核病陽性牛和陰性牛的轉(zhuǎn)錄水平差異較小，作為分子標識可能會發(fā)生漏檢。因此，TNF-α并不適合作為牛結(jié)核病的分子標識。IL-12p40與IFN-γ、IP-10和TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄水平之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.47、0.15和0.45，且結(jié)核病陽性牛和陰性牛的PBLC經(jīng)CE刺激后，IL-12p40轉(zhuǎn)錄水平無顯著性差異，因此IL-12p40不適合作為牛結(jié)核病的分子標識。結(jié)核病陽性牛PBLC經(jīng)CE刺激后，IP-10的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于結(jié)核病陰性牛，且其轉(zhuǎn)錄水平與IFN-γ呈正相關(guān)(Spearman r=0.65)，有作為牛結(jié)核病診斷標識的潛力。

為了獲得基于IFN-γ、IP-10和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR檢測方法的cutoff值和其相對的檢測靈敏度和特異性，比較IFN-γ、TNF-α和IP-10作為牛結(jié)核病分子標識的潛力，ROC方法分析10頭結(jié)核病陽性牛和5頭陰性健康牛的CE刺激后PBLC中各細胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，分析結(jié)果如表2。結(jié)果顯示以IFN-γ、TNF-α和IP-10的mRNA轉(zhuǎn)錄水平建立的Real-Time PCR檢測方法的曲線下面積(AUC)均大于0.9，表明該方法能夠較為真實地反應(yīng)牛分枝桿菌的感染情況。由于用于ROC分析的樣本量少，在篩選cutoff值時，只能從60%、80%和100%的特異性中進行選擇，考慮到本次試驗中我們選擇的陽性牛個體細胞免疫反應(yīng)均很強，細胞因子的相對表達量也高于文獻報道，如果選擇特異性100%作為指標，獲得的cutoff值很可能會偏大，會造成漏檢，因此，選擇特異性為80%，則IFN-γ、TNF-α和IP-10的cutoff值分別為10.45、6.762和1.403，其檢測靈敏度均可達90%以上。

表1 細胞因子熒光定量PCR檢測方法的ROC分析Tab 1 ROC analysis of Cytokines-based Real-Time PCR diagnostic methods

2.3 牛結(jié)核病細胞因子診斷標識的驗證 感染后20 w，利用IGRA、CE-based IGRA檢測6頭試驗牛，結(jié)果顯示3頭M.bovis68002感染牛呈牛結(jié)核病陽性，3頭PBS注射牛呈牛結(jié)核病陰性(數(shù)據(jù)未顯示)。分別于感染前和感染后30 w采集全血，無菌分離PBLC經(jīng)CE和PBS刺激后，Real-Time PCR檢測IFN-γ和IP-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示M.bovis68002感染牛的PBLC經(jīng)CE刺激后，其IFN-γ和IP-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于感染PBS對照牛，因此CE誘導(dǎo)的IP-10的轉(zhuǎn)錄水平與牛分枝桿菌感染相關(guān)，有作為牛結(jié)核病分子標識的潛力。

2.4 臨床檢測結(jié)果 利用建立的牛結(jié)核病Real-Time PCR檢測方法，檢測臨床篩選的14頭結(jié)核病陽性牛，基于IFN-γ和IP-10 mRNA Real-Time PCR方法檢出率分別為71.4%(10/14)和78.57%(11/14)。

圖3 CE誘導(dǎo)的IFN-γ和IP10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig 3 The mRNA transcription levels of CE induced IFN-γ and IP10

3 討 論

細胞因子在結(jié)核病發(fā)病進程中起重要作用，探討細胞因子的表達水平與牛結(jié)核病之間的關(guān)系，篩選能夠作為結(jié)核病診斷用的新型分子標識也是目前結(jié)核病研究領(lǐng)域的熱點之一。IFN-γ是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，具有抗病毒和細胞毒的活性，還能夠激活巨噬細胞, 促進細胞因子的釋放, 增強巨噬細胞的吞噬作用，是目前用于檢測人和動物結(jié)核病的細胞因子[8-9]。其原理是：在體外培養(yǎng)條件下，外周血淋巴細胞(PBLC)再次接觸分枝桿菌特異抗原后被活化，表達并釋放大量的IFN-γ，通過Real-Time PCR檢測IFN-γ的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，或利用ELISA蛋白表達水平，或利用ELISPOT技術(shù)檢測分泌IFN-γ的淋巴細胞進行數(shù)來判斷人或動物是否感染結(jié)核病。但是該方法并不能區(qū)分結(jié)核病的感染期，因此，科研工作者不斷尋找新的細胞因子作為檢測靶標，以適應(yīng)不同的檢測需求[10-11]。

研究人員用CE、PPDB或TB10.4刺激人外周血淋巴細胞，對比細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-12p40、IL-13、IL-17和IL-18的表達水平發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-12p40能夠用于區(qū)分人結(jié)核病的開放期和潛伏期感染[12]；IP-10是IFN-γ趨化因子10(monocyte-derived chemokine IFN-γ-induced protein 10，亦名為CXCL10)，是最新發(fā)現(xiàn)的人結(jié)核病分子標識，有作為治療監(jiān)測和人結(jié)核病進程分子標識的潛力[11, 13-15]。為了研究細胞因子與牛結(jié)核病之間的相關(guān)性，篩選新的牛結(jié)核病分子標識，本研究首先利用Real-Time PCR檢測了不同抗原刺激后的田間篩選的結(jié)核病陽性牛和陰性牛的PBLC的IL-12 p40、IP-10、IFN-γ和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病陽性牛CE誘導(dǎo)IP-10和IFN-γ顯著高于結(jié)核病陰性牛，且CE誘導(dǎo)的IP-10和IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平具有良好的相關(guān)性；其次發(fā)現(xiàn)M.bovis68002感染牛的PBLC經(jīng)CE刺激后，IP-10和IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平顯著高于PBS對照牛，證實CE誘導(dǎo)的IP-10與牛分枝桿菌感染相關(guān)；最后用建立的Real-Time PCR方法檢測14頭田間篩選的結(jié)核病陽性牛，IP-10 Real-Time PCR檢測出11頭陽性，IFN-γ Real-Time PCR檢測出10頭陽性牛，從而進一步證實CE誘導(dǎo)的IP-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平有作為牛結(jié)核病分子標識的潛力。

然而，研究的局限之處在于田間樣本量較少，難以獲得IP-10 Real-Time PCR檢測方法準確的cutoff值，此外，也未能檢測IP-10的蛋白質(zhì)表達水平，未能證實CE誘導(dǎo)的血漿中IP-10是否可以作為牛結(jié)核病分子標識，有待進一步研究。

4 小 結(jié)

研究發(fā)現(xiàn)IP-10的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與牛分枝桿菌感染相關(guān)，結(jié)核病陽性牛的外周血淋巴細胞經(jīng)牛分枝桿菌特異性抗原CE刺激后，其IP-10的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與IFN-γ呈正相關(guān)，且均顯著高于結(jié)核病陰性牛，建立的IP-10 Real-Time PCR方法對14頭結(jié)核病陽性牛的檢出率可達78.57%。因此，CE誘導(dǎo)的IP-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平有作為牛結(jié)核病分子標識的潛力，但其蛋白表達水平是否可以作為牛結(jié)核病分子標識則有待進一步探究。

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