腐稈劑快速分解的水稻秸稈活性成分分析與紅外光譜表征

劉峙嶸，劉大前，王長(zhǎng)福，王 云，陳 帥

(1.東華理工大學(xué)省部共建核資源與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江西南昌 330013；2.東華理工大學(xué)核科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330013)

秸稈通常指的是農(nóng)作物在收獲籽實(shí)后剩余的莖葉部分，數(shù)量巨大，并隨著糧食產(chǎn)量的加大而逐年增長(zhǎng)。由于秸稈數(shù)量巨大，腐解速率緩慢，攜帶病菌，而且秸稈難消化、蛋白質(zhì)含量低、木質(zhì)素和硅含量較高，不適合做動(dòng)物飼料，因此如何處理這些數(shù)量巨大的秸稈成為目前一大難題。很多國(guó)家通常直接將秸稈進(jìn)行焚燒處理，這又產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，并且對(duì)公眾健康產(chǎn)生了威脅。因此，作為豐富的可再生資源，秸稈的合理開發(fā)和利用對(duì)全球能源危機(jī)的緩解和環(huán)境污染的改善有著重要的意義。秸稈中含有大量的有機(jī)質(zhì)和微量元素，將其作為還田肥料可以有效地提高土壤肥力，對(duì)改善我國(guó)養(yǎng)分失調(diào)的土壤有著深遠(yuǎn)的意義。目前，秸稈還田技術(shù)在發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)十分成熟，普及率相對(duì)較高，并且獲得了不錯(cuò)的效果[1]。正常條件下，秸稈腐解速率緩慢，養(yǎng)分釋放量低。還田時(shí)施用腐稈劑可以有效增加微生物數(shù)量，加速秸稈腐解，提高養(yǎng)分釋放量，并且對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量的增加有顯著促進(jìn)效果[2]。

秸稈主要由植物的細(xì)胞壁物質(zhì)即木質(zhì)素、纖維素和半纖維素構(gòu)成，這3種物質(zhì)通過(guò)化學(xué)鍵相互緊貼在一起，形成一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致秸稈很難被降解。自然界中的微生物種類繁多，其中不乏一些能將纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解的種類，這些微生物代謝所產(chǎn)生的一系列酶能將秸稈粗纖維中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等大分子碳水化合物降解為低分子的單糖或多糖[3]。但是單一菌種分泌的酶系有限，秸稈很難在1種菌種下完全降解，需要多種微生物產(chǎn)生多種酶系來(lái)協(xié)同完成降解[4]。腐稈劑是一種高效的微生物制劑[5]，其中富含各種能分解細(xì)胞壁木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的微生物[6]，能很好地對(duì)秸稈進(jìn)行降解。傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)具有無(wú)損、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛用于農(nóng)作物秸稈腐解研究。本試驗(yàn)采用傅里葉變換紅外光譜法，通過(guò)測(cè)定添加腐稈劑后水稻秸稈樣品中纖維素酶、半纖維素酶的活性，微生物的數(shù)量以及木質(zhì)纖維素三組分的含量，探討了腐稈劑快速分解水稻秸稈的生物化學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所選取的秸稈來(lái)自江西省南昌市新建縣某稻田，屬于第二季水稻的秸稈，采用抽選的方法從一片稻田的水稻中抽取適量作為研究對(duì)象。將新鮮水稻秸稈放置在陽(yáng)光下自然風(fēng)干半個(gè)月，風(fēng)干后將秸稈剪至5 cm左右，用多功能粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)40目篩，放置在干燥箱中，105 ℃下烘干備用。試驗(yàn)所用腐稈劑包括特定的細(xì)菌、真菌和放線菌組合，由上海聯(lián)業(yè)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

主要試劑：無(wú)水醋酸鈉、冰醋酸、3，5-二硝基水楊酸、木糖、四水合酒石酸鉀鈉、重蒸苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉、木聚糖、無(wú)水葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、二水合乙二胺四乙酸二鈉、十水合硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、乙二醇乙醚、無(wú)水磷酸氫二鈉，分析純，均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)股份有限公司提供。

主要儀器：DZ-2BCⅡ型真空干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)、Nicolet IS5型傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)、SXL-1216型程控箱式電爐(馬弗爐)(杭州市卓馳儀器有限公司)、721型分光光度計(jì)(天津冠澤科技有限公司)、SHA-B型恒溫水浴振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定被腐稈劑腐解的水稻秸稈中纖維素酶活性和半纖維素酶活性，細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量的變化和木質(zhì)纖維素三組分含量的變化，再加以空白對(duì)照，分析腐稈劑在加速水稻秸稈腐解過(guò)程中的影響和作用途徑。在一系列容量為250 mL的錐形瓶中加入5 g秸稈樣品，然后加入0.05 g腐稈劑、1 mL尿素溶液(50 g/L)和pH值為7的水。用保鮮膜封口，放入恒溫箱中，30 ℃下培養(yǎng)。每隔3 d取出1個(gè)樣品，1 g用于酶活力的測(cè)定，1 g用于微生物數(shù)量的測(cè)定。剩下的樣品在105 ℃下干燥，測(cè)含水量，用于樣品干質(zhì)量計(jì)算，干燥后的樣品用于木質(zhì)纖維素三組分的測(cè)定和紅外光譜分析。

1.3 分析方法

1.3.1 纖維素酶活力的測(cè)定 纖維素酶活力的測(cè)定采用DNS(3，5-二硝基水楊酸)顯色法[7]，主要檢測(cè)內(nèi)切葡聚糖酶。

待測(cè)酶液的制備：準(zhǔn)確稱取1 g秸稈樣品于100 mL錐形瓶中，加醋酸-醋酸鈉緩沖液20 mL，放入搖床中200 r/min浸提1 h。浸提完畢后略靜置，將上清液置于離心管中，在 10 000 r/min 下離心10 min。離心后的上清液根據(jù)酶活力大小，稀釋至適當(dāng)濃度，即為待測(cè)酶液。

樣品的測(cè)定：取1% CMC溶液3 mL和待測(cè)酶液1 mL于試管中，置于恒溫水浴鍋中50 ℃下糖化30 min；空白樣取1% CMC溶液3 mL和待測(cè)酶液1 mL于試管中，沸水浴 10 min 使酶失活，再置于恒溫水浴鍋中50 ℃下糖化30 min。糖化后立即沸水浴煮10 min使酶失活，得糖化液，冷卻后加入3 mL DNS試劑，再沸水浴10 min，冷卻后用25 mL容量瓶加水定容?？瞻讟佑糜谡{(diào)零，用分光光度計(jì)測(cè)樣品在波長(zhǎng)為550 nm下的吸光度。本試驗(yàn)以1 min內(nèi)生成1 μg葡萄糖量所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)，計(jì)算公式如下：

(1)

式中：C表示測(cè)得的葡萄糖濃度，mg/mL；N表示酶液稀釋總倍數(shù)；t表示反應(yīng)時(shí)間，min；V表示樣品的體積，mL；m表示樣品干質(zhì)量，g。

1.3.2 半纖維素酶活力的測(cè)定 半纖維素酶活力的測(cè)定同樣采用DNS(3，5-二硝基水楊酸)顯色法，主要檢測(cè)木聚糖酶活力。取1%木聚糖溶液3 mL和待測(cè)酶液1 mL于試管中，置于恒溫水浴鍋中50 ℃下糖化60 min；空白樣取1%木聚糖溶液3 mL和待測(cè)酶液1 mL于試管中，沸水浴10 min使酶失活，再置于恒溫水浴鍋中50 ℃下糖化30 min。糖化后立即于沸水浴中煮10 min使酶失活，得糖化液，冷卻后加入 3 mL DNS試劑，再沸水浴10 min，冷卻后用25 mL容量瓶加水定容?？瞻讟佑糜谡{(diào)零，用分光光度計(jì)測(cè)樣品在波長(zhǎng)為550 nm下的吸光度。本試驗(yàn)以1 min內(nèi)生成1 μg木糖量所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)，計(jì)算公式如下：

(2)

式中：C表示測(cè)得的木糖濃度，mg/mL；N表示酶液稀釋總倍數(shù)；t表示反應(yīng)時(shí)間，min；V表示樣品的體積，mL；m表示樣品干質(zhì)量，g。

1.3.3 微生物群落的演替 用稀釋平板計(jì)數(shù)方法[6]分別計(jì)算細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量。稱取1 g秸稈樣品置于 250 mL 錐形瓶中，加入99 mL水，置于搖床中振蕩5 min使秸稈樣品均勻分散在稀釋液中成為稻稈粉末懸液。將懸濁液逐級(jí)稀釋得到不同稀釋度的溶液，待測(cè)。

1.3.4 木質(zhì)纖維素三組分的測(cè)定 秸稈樣品中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測(cè)定采用差重法[8]。準(zhǔn)確稱取1 g干燥后的秸稈樣品于250 mL錐形瓶中，加入100 mL中性洗滌劑，置于恒溫鍋中100 ℃下油浴1 h，用熱水洗滌至無(wú)中性洗滌劑，再用丙酮洗滌2次，將殘?jiān)糜诟稍锵鋬?nèi)105 ℃干燥至恒質(zhì)量m1(g)；將殘?jiān)D(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶?jī)?nèi)，加入70 mL 2 mol/L鹽酸，置于恒溫鍋中100 ℃下油浴1 h，用水洗滌至中性，再依次用適量的95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮洗滌2次，將殘?jiān)诟稍锵渲?05 ℃下干燥至恒質(zhì)量m2(g)；將殘?jiān)D(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶?jī)?nèi)，加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72%的冷硫酸，室溫降解 4 h 后加90 mL水，24 h后用水洗滌殘?jiān)羛H值為6.5，105 ℃干燥至恒質(zhì)量m3；將殘?jiān)糜谯釄逯?，于馬弗爐中550 ℃下灼燒4 h，剩余質(zhì)量m4。計(jì)算三組分含量，公式如下：

(3)

(4)

(5)

式中：m0表示秸稈初始質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 腐解前后秸稈樣品紅外光譜分析

秸稈樣品腐解前后的紅外譜圖如圖1所示。

對(duì)比秸稈樣品腐解前后的紅外譜圖可知，腐解后的秸稈樣品在3 300～3 500 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度比腐解前的明顯減弱，這表明秸稈腐解后所含酚羥基或者醇羥基有所減少，根據(jù)吸收峰的歸屬分析，這主要是秸稈中纖維素被降解，其中的羥基含量降低；2 920 cm-1處吸收峰減弱，說(shuō)明腐解后秸稈中的碳水化合物和脂肪族化合物被降解，導(dǎo)致部分甲基和亞甲基被降解；1 610 cm-1處吸收峰強(qiáng)度減弱，表示有機(jī)羧酸被降解，含量減少；1 520 cm-1處吸收峰強(qiáng)度略有減弱，說(shuō)明酰胺中的N—H鍵被破壞，這表示氨基酸被分解；1 430 cm-1處吸收峰的強(qiáng)度有所減弱，這表明秸稈中的脂肪族化合物、木質(zhì)素以及碳水化合物被降解[9]。1 380 cm-1處吸收峰強(qiáng)度減弱，說(shuō)明脂肪類化合物被大量分解，氨基的含量大量減少；1 320 cm-1處吸收峰的強(qiáng)度減弱，說(shuō)明木質(zhì)素被降解，C—O鍵減少；1 230 cm-1處吸收峰強(qiáng)度減弱，說(shuō)明纖維素被降解，含量降低，C—O鍵、Si—O鍵減少。

2.2 腐稈劑對(duì)水稻秸稈腐解過(guò)程中酶的影響

腐解過(guò)程是微生物將復(fù)雜有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化成簡(jiǎn)單有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)物的過(guò)程，其中的關(guān)鍵物質(zhì)就是微生物產(chǎn)生的水解酶，腐解反應(yīng)礦化進(jìn)程和強(qiáng)度都由酶的活性直接反映[10]。CMC酶和木聚糖酶都是水解酶的一種，在腐解過(guò)程中起著重要的作用。試驗(yàn)所得腐解過(guò)程中CMC酶和木聚糖酶的變化曲線見圖2、圖3。

從圖2可以看出，添加腐稈劑的秸稈樣品中CMC酶活在腐解前期上升迅速，16 d出現(xiàn)最高酶活9.01 U/g，之后酶活開始急速降低。空白樣中的酶活上升緩慢，16 d出現(xiàn)最高酶活5.62 U/g，之后酶活緩慢下降。由圖3可知，添加腐稈劑的秸稈樣品中木聚糖酶的活性變化趨勢(shì)與CMC酶相似，為先升高后下降，最高酶活出現(xiàn)在16 d，為12.25 U/g?？瞻讟又心揪厶敲富畹淖兓厔?shì)較緩慢，最高酶活出現(xiàn)在16 d，為 7.96 U/g。因此，無(wú)論是CMC酶活還是木聚糖酶活都隨著腐解進(jìn)程先升高后下降，造成這樣的原因可能是腐解前期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，微生物代謝旺盛，產(chǎn)酶能力強(qiáng)；而隨著時(shí)間增長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)開始供應(yīng)不足，微生物產(chǎn)酶能力降低。添加腐稈劑后的樣品中CMC酶和木聚糖酶的最高酶活和平均酶活都明顯高于空白樣，說(shuō)明添加腐稈劑能夠顯著提高水稻秸稈腐解各個(gè)階段的CMC酶活和木聚糖酶活[11]，從而促進(jìn)纖維素和半纖維素的快速降解。

2.3 腐稈劑對(duì)水稻秸稈腐解過(guò)程中微生物數(shù)量的影響

微生物代謝在水稻秸稈腐解過(guò)程中起著重要作用，因此，對(duì)腐解過(guò)程中微生物數(shù)量變化進(jìn)行分析十分必要。本試驗(yàn)測(cè)得的腐解過(guò)程中微生物變化曲線見圖4、圖5、圖6。

從圖4可以看出，添加腐稈劑的秸稈樣品在整個(gè)腐解階段的細(xì)菌數(shù)量都高于空白樣，這說(shuō)明腐稈劑在整個(gè)腐解過(guò)程中都促進(jìn)了細(xì)菌生長(zhǎng)。從圖5可以看出，添加腐稈劑的秸稈樣品的真菌數(shù)量在腐解開始時(shí)略高于空白樣，12 d后數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)開始變得越來(lái)越明顯，這說(shuō)明了腐稈劑對(duì)腐解過(guò)程中真菌數(shù)量的提升主要體現(xiàn)在腐解后期。從圖6可以看出，添加腐稈劑的樣品中放線菌數(shù)量在腐解前期就有一定的優(yōu)勢(shì)，雖然在4～8 d優(yōu)勢(shì)開始縮小，但8 d后優(yōu)勢(shì)又開始擴(kuò)大，并持續(xù)保持一定優(yōu)勢(shì)，這說(shuō)明腐稈劑對(duì)整個(gè)腐解過(guò)程中放線菌的數(shù)量有一定的促進(jìn)作用[12]。

2.4 腐稈劑對(duì)水稻秸稈腐解過(guò)程中木質(zhì)纖維素三組分降解的影響

纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是水稻秸稈的主要成分，對(duì)腐解過(guò)程中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解進(jìn)行分析是很有必要的。本試驗(yàn)所得腐解過(guò)程中木質(zhì)纖維素三組分降解動(dòng)態(tài)見圖7、圖8、圖9。

從圖7可以看出，無(wú)論是否添加腐稈劑，秸稈樣品腐解過(guò)程中纖維素的降解速率都是先慢后加快再變慢。這是因?yàn)樵诩?xì)胞壁結(jié)構(gòu)中，纖維素被木質(zhì)素和半纖維素緊緊纏繞，很難降解；但隨著腐解的進(jìn)行，半纖維素和木質(zhì)素被部分降解，被包裹的纖維素漸漸裸露出來(lái)，降解速度開始加快；腐解后期由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足導(dǎo)致微生物產(chǎn)酶下降[13]，導(dǎo)致降解速率下降。這與腐解過(guò)程中CMC酶動(dòng)態(tài)反映的結(jié)果基本一致。添加腐稈劑的樣品腐解24 d纖維素的降解率為35.24%，比空白樣高出了9.4百分點(diǎn)，說(shuō)明了腐稈劑的添加在一定程度上促進(jìn)了纖維素的降解。從圖8可以看出，腐解過(guò)程中半纖維素在腐解前期就表現(xiàn)出了較快的降解速率，但隨著時(shí)間增長(zhǎng)腐解速率開始下降，這與腐解過(guò)程中木聚糖酶動(dòng)態(tài)變化反映的情況基本一致。腐解24 d，添加腐稈劑的樣品半纖維素降解率為 38.36%，比空白樣高出了12.88百分點(diǎn)，說(shuō)明腐稈劑的添加在一定程度上促進(jìn)了半纖維素的降解。從圖9可以看出，在腐解前8 d添加腐稈劑的樣品中木質(zhì)素降解率與空白樣之間并沒有明顯差異，8 d后才表現(xiàn)出更強(qiáng)的降解能力。腐解24 d添加腐稈劑的樣品中木質(zhì)素降解率僅為14.35%，但比空白樣高出了5.14百分點(diǎn)，這說(shuō)明了雖然腐稈劑的添加促進(jìn)了木質(zhì)素的降解，但降解率還是相對(duì)較低。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定被腐稈劑腐解的水稻秸稈中纖維素酶、半纖維素酶的活性，微生物的數(shù)量以及木質(zhì)纖維素三組分的含量，并對(duì)比腐解前后秸稈樣品的紅外光譜圖，探究了腐稈劑快速分解水稻秸稈的機(jī)制，所得結(jié)果有：對(duì)比腐解前后秸稈的紅外譜圖發(fā)現(xiàn)，腐解后的秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等碳水化合物發(fā)生分解，使羥基和亞甲基基團(tuán)減少，同時(shí)也表明酚類化合物被氧化成醌類物質(zhì)；秸稈中的蛋白質(zhì)和氨基酸分解后生成酰胺類化合物、硝酸鹽和銨鹽。腐稈劑的添加能顯著提升水稻秸稈腐解過(guò)程中CMC酶和木聚糖酶的活性，并且酶的活性都隨著時(shí)間的增長(zhǎng)先升高后降低。腐稈劑中的微生物組合能根據(jù)水稻秸稈腐解的不同階段起到不同的作用來(lái)影響降解過(guò)程。腐稈劑的添加能促進(jìn)水稻秸稈腐解過(guò)程中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解，但木質(zhì)素降解率相對(duì)較低。此外，秸稈中各活性成分的降解速率和降解百分比還有待提高，腐稈劑的最佳腐解條件還需進(jìn)一步研究。

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