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    響應(yīng)面優(yōu)化提取草莓多酚及其抗氧化活性研究

    2018-03-05 08:02:40李芬芳馬艷弘趙密珍黃開紅段云青
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年1期
    關(guān)鍵詞:草莓自由基乙醇

    李芬芳,馬艷弘,趙密珍,黃開紅,段云青

    (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院,山西太谷 030801;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所,江蘇南京 210014;4.句容萬山紅遍生物科技有限公司,江蘇鎮(zhèn)江 212402)

    草莓(FragariaananassaDuck)為薔薇科植物草莓的果實,別稱有洋莓、地莓、蠶莓、蛇莓、雞冠果等[1]。草莓含有豐富的多酚、花青素、酚酸和黃酮類等生物活性物質(zhì),不僅具有較強的抗氧化能力,同時還具有較高的清除自由基的能力[2-3]。此外,草莓中含有豐富的維生素C、維生素E、β胡蘿卜素、褪黑激素及酚類化合物等抗氧化物質(zhì)[4],其中酚類化合物是最能影響草莓植物化學(xué)性質(zhì)的主要組成成分之一[5]。酚類物質(zhì)為草莓中最主要的抗氧化物質(zhì),在抗氧化、抑菌、抗癌、抗腫瘤和抑制心腦血管疾病等方面具有顯著功效,被廣泛用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[6]。近些年通過大量引進國外的優(yōu)質(zhì)草莓品種,我國的草莓種類和數(shù)量已經(jīng)位于世界前列。國內(nèi)對草莓的采后保鮮以及貯藏進行了很多研究,但是對草莓的生物活性及生理功能的研究還處于起步階段,與國際上的研究存在有很大的差距[7],因而需進一步開發(fā)市場前景廣闊的草莓多酚活性產(chǎn)品[8-9]。

    國內(nèi)外很多學(xué)者對植物多酚的提取方法做了大量的研究,采用的方法主要有溶劑萃取法、酶解提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法等[10-12]。其中溶劑萃取法因其操作簡便、成本低廉、便于后續(xù)分離純化等優(yōu)點成為目前國內(nèi)使用最廣泛的多酚提取方法。目前國內(nèi)對植物多酚的提取、純化和生物活性的研究主要集中在茶多酚、蘋果多酚、石榴多酚等少數(shù)幾種,而有關(guān)草莓多酚的提取及抗氧化活性的報道卻不多。本試驗擬對草莓多酚提取工藝條件進行優(yōu)化,并測定草莓多酚粗提物的體外抗氧化能力,旨在為草莓的深度開發(fā)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    草莓由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所提供;福林酚試劑,源葉生物技術(shù)有限公司;DPPH,上海源葉生物科技有限公司;羥自由基測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;無水乙醇、沒食子酸、碳酸鈉(均為分析純試劑),北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    FW100高速萬能粉碎機:天津市泰斯特儀器有限公司;HJ-6A多頭磁力攪拌器:常州國華儀器有限公司;DK-8D型電熱恒溫水槽:上海精宏實驗設(shè)備有限公司;D-B5型紫外可見分光光度計:上海奧析科學(xué)儀器有限公司;JJ-500電子天平:常熟市雙杰測試儀器廠;TGL-16B臺式離心機:上海安亭科學(xué)儀器廠;RE6000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;ZD-F12真空冷凍干燥機:南京載智自動化設(shè)備有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 草莓多酚提取方法 將新鮮草莓洗凈、瀝干水分、破碎打漿,與一定濃度的乙醇溶液混合均勻,恒溫提取一定時間,4 500 r/min離心25 min,沉淀再重復(fù)提取2次,合并3次上清,得多酚提取液。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,用HPD400大孔樹脂純化,50%乙醇溶液洗脫3次,合并洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,真空冷凍干燥至恒質(zhì)量得草莓多酚粉。

    1.3.2 總酚的測定 采用福林酚比色法[13-14]測定,以沒食子酸為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別加入5 mL蒸餾水,1 mL 福林酚試劑和3 mL 7.5% Na2CO3溶液,45 ℃水浴加熱90 min后,在波長760 nm處測吸光度,得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度與吸光度的回歸方程:y=0.011 27x+0.001 97(r2=0.999 8),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算草莓多酚含量,再按照如下公式計算多酚提取得率:多酚得率(按沒食子酸計)(mg/g)=(C×V/m)×100%,式中C為比色杯中多酚質(zhì)量濃度(mg/mL),V為多酚提取液總體積(mL);m為草莓總質(zhì)量(g)。

    1.3.3 單因素試驗設(shè)計 分別以料液比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)4個因素作單因素試驗,考察各因素對多酚提取量的影響。

    1.3.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面設(shè)計,優(yōu)化草莓多酚的提取工藝。

    1.3.5 抗氧化活性測定

    1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定[15-16]準(zhǔn)確稱取 12.5 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)品,用無水乙醇溶解并定容至250 mL。準(zhǔn)確量取不同體積的樣品溶液,加去氧水補足1 mL,分別加入5 mL DPPH·溶液,充分混合,靜止30 min,于517 nm處測吸光值DS,5 mL DPPH·溶液與1 mL無水乙醇混合后測吸光度D0,5 mL無水乙醇與1 mL樣品溶液混合后測吸光度Db。以同濃度維生素C為對照,在517 nm處測吸光度。每個樣品平行測定3次,DPPH·清除率公式如下:

    清除率=[D0-(DS-Db)]/D0×100%。

    1.3.5.2 抗超氧陰離子自由基能力測定 配制0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的樣品溶液,按照試劑盒說明書操作,取同濃度維生素C溶液作為對照,無水乙醇作空白對照,超氧陰離子自由基清除能力計算公式如下:

    抗超氧陰離子活力單位(U/L)=(D550 nm(對照組)-D550 nm(試驗組))/(D550 nm(對照組)-D550 nm(標(biāo)準(zhǔn)組))×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)×1 000 mL。

    1.3.5.3 清除羥自由基能力的測定 分別取0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的樣品溶液,按照試劑盒說明書操作,其呈色與·OH的多少呈正比關(guān)系,即吸光度越小,樣品對羥自由基的清除能力越強。取同濃度維生素C溶液作為對照,無水乙醇作空白對照,羥自由基抑制能力計算公式:抑制率=(D對照組-D試驗組)/D對照組×100%。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 草莓多酚提取單因素試驗結(jié)果與分析

    2.1.1 料液比對草莓多酚得率的影響 在50 ℃分別以料液比1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40(g ∶mL),70%乙醇濃度對草莓漿液浸提2 h,隨料液比增大,多酚提取率逐漸增大,在1 g ∶35 mL處多酚得率達到最大值,說明多酚的溶出量已經(jīng)達到飽和,故最終確定最佳提取料液比為1 g ∶35 mL(圖1)。

    2.1.2 提取時間對草莓多酚得率的影響 在50 ℃以料液比 1 g ∶20 mL 、70%乙醇濃度對草莓漿液分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h。在提取時間2 h以內(nèi),多酚提取率對著提取時間的延長而逐漸增大,超過2 h以后,提取率逐漸趨于平緩。表明充足的提取時間可以使溶劑充分接觸,從而提高得率,當(dāng)時間超過2 h以后,多酚溶出基本達到平衡狀態(tài)(圖2)。因此,確定最佳提取時間為2 h。

    2.1.3 乙醇濃度對草莓多酚得率的影響 以料液比 1 g ∶20 mL,50 ℃對草莓漿液進行提取,乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。如圖3所示,當(dāng)乙醇濃度小于50%時,隨著乙醇濃度的增加總多酚提取率逐漸提高,當(dāng)乙醇濃度達到50%時,總多酚的提取率達到最大,此后隨著乙醇濃度的增加其提取率逐漸減小(圖3)??赡苁怯捎谶^高濃度的乙醇溶液會引起細胞蛋白質(zhì)的變性,影響多酚類物質(zhì)的溶出,導(dǎo)致提取率降低[17],最終確定最佳提取乙醇濃度為50%。

    2.1.4 溫度對草莓多酚得率的影響 以料液比1 g ∶20 mL,70%乙醇濃度對草莓漿液提取2 h,溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃,小于60 ℃范圍內(nèi),隨著提取溫度的升高,提取率逐漸升增高,當(dāng)溫度大于60 ℃后,多酚得率呈下降趨勢(圖4)。表明溫度越高越有利于多酚的溶出,但是溫度太高,草莓中的酚類物質(zhì)有可能因溫度過高發(fā)生氧化等變化[18],且溫度增高需要更多的熱能,從節(jié)能經(jīng)濟的角度出發(fā),確定最佳提取溫度為60 ℃。

    2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

    2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析 根據(jù)Box-Behnken原理,綜合單因素試驗結(jié)果,以草莓多酚得率為響應(yīng)值,通過響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化提取條件。選取料液比(A)、提取時間(B)、乙醇濃度(C)、提取溫度(D)為自變量,采用4因素3水平共29個試驗點的響應(yīng)面法分析試驗(表1、表2)。

    表1 草莓多酚提取工藝響應(yīng)面分析試驗的因素與水平

    表2 草莓多酚提取工藝響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果

    應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸分析,得到以草莓多酚提取率為響應(yīng)值的回歸方程為:Y=2.44+0.083A-0.13B-0.054C+0.097D-0.14AB-0.074AC-0.083AD+0.044BC+0.073BD+0.047CD-0.22A2-0.31B2-0.12C2-0.084D2。

    表3 方差分析結(jié)果

    注:“**”表示影響極顯著(P<0.01),“*”表示影響顯著(P<0.05),N表示影響不顯著(P>0.05)。

    2.2.2 響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化 響應(yīng)曲面圖中曲面的陡峭程度可以表明變量對提取率的影響程度,曲面較陡表明影響較大,反之則較小;等高線圖反映了因素間交互作用的強弱,橢圓形表示交互作用顯著,圓形則表示交互作用不顯著(圖5)。根據(jù)回歸方程,作響應(yīng)面圖,考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀,分析液料比、時間、乙醇濃度和溫度對提取量的影響。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反[20]。料液比與時間交互作用的響應(yīng)面坡度陡,說明二者交互作用顯著;同一提取時間下,隨料液比增加,提取率增加;與之相比,在同一料液比的水平下,隨著提取時間的增加,提取率達到最佳后開始減小(圖5-a)。料液比與乙醇濃度交互作用的響應(yīng)面坡度較陡,等高線較密集,說明二者交互作用顯著;同一乙醇濃度下,隨料液比增加,提取率增加;與之相比,在同一料液比的水平下,隨著乙醇濃度的增加,提取率增加幅度較緩慢(圖5-b)。料液比與溫度交互作用的響應(yīng)面坡度較陡,等高線密集,說明二者交互作用較顯著;在同一溫度下,隨料液比增加,提取率增加;與之相比,在同一料液比的水平下,隨著溫度的增加,提取率增加幅度緩慢(圖5-c)。對圖5進行分析可得出,溫度、時間和料液比對多酚提取量影響極為顯著,乙醇濃度對多酚提取量影響最小。

    2.2.3 響應(yīng)面最優(yōu)提取工藝條件及驗證試驗 通過軟件分析得到草莓多酚醇提最佳提取工藝為:料液比1 g ∶40 mL、時間 1.74 h、乙醇濃度43.07%、浸提溫度56.62 ℃,在此條件下,草莓多酚醇提得率為2.417 29 mg/g。為了操作方便,修正最佳提取工藝條件為:料液比1 g ∶40 mL、時間104 min、乙醇濃度43%、浸提溫度57 ℃。在此條件下,進行3次平行試驗,所得提取率平均值為2.392 mg/g,實測值與預(yù)測值相對誤差為0.73%,說明該優(yōu)化設(shè)計方案可以較好地預(yù)測草莓多酚醇提情況。

    2.3 抗氧化活性測定

    2.3.1 對DPPH自由基的清除能力 隨著溶液濃度的增加,草莓多酚DPPH·自由基能力逐漸增強,在相同質(zhì)量濃度下,草莓多酚清除DPPH·的能力低于維生素C。當(dāng)草莓多酚溶液濃度達0.16 mg/mL時,其清除率為93.33%(圖6)。

    2.3.2 對超氧陰離子的清除能力 隨著溶液濃度的增加,2種樣品抗超氧陰離子自由基能力不斷增強;相同濃度條件下,維生素C抗自由基能力高于草莓多酚樣品。當(dāng)草莓多酚溶液濃度達0.16 mg/mL濃度時,其抗自由基能力達 165.16 U/L(圖7)。

    2.3.3 對羥自由基的清除能力 隨著2種樣品溶液濃度的增加,羥自由基抑制率不斷增加。同濃度時維生素C對羥自由基的抑制能力大于草莓多酚樣品。當(dāng)草莓多酚濃度達 0.16 mg/mL 時,羥自由基抑制率達78.68%(圖8)。

    3 結(jié)語

    通過單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化,確定草莓多酚提取的最佳試驗條件為料液比1 g ∶40 mL、提取時間104 min、乙醇濃度43%、提取溫度57 ℃。各因素對多酚得率的影響從大到小依次為提取時間>提取溫度>料液比>乙醇濃度。此最佳工藝條件下草莓多酚的提取率(按沒食子酸計)為2.392 mg/g。用所提取的草莓多酚粗提物對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基的清除能力進行體外抗氧化評價試驗,可以發(fā)現(xiàn)其具有較強的自由基清除力,在一定的濃度范圍內(nèi),提取液質(zhì)量濃度與氧化活性呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。隨著草莓多酚濃度呈線性增加,當(dāng)多酚濃度為0.16 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率達到93.33%,抗超氧陰離子能力達165.16 U/L,對羥自由基抑制率達78.68%。

    隨著近幾年對植物多酚研究的不斷深入,多酚類物質(zhì)的抗氧化作用開始被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域,因此草莓中酚類物質(zhì)作為一種功能性食品添加劑具有廣闊的開發(fā)前景。因此,本方法所優(yōu)化提取的草莓多酚實際上是一種良好的天然抗氧化劑的前體物質(zhì),極具深入研究和開發(fā)的價值。

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