鴨源H9N2亞型禽流感病毒RT-PCR檢測方法的建立

王永娟，董亞青，郭方超，左偉勇，孟 婷

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇泰州 225300)

禽流感(avian influenza，AI)是由A型禽流感病毒中的禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一種傳染病，其病原屬于正黏病毒科、流感病毒屬[1]。按其致病性可分為高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒、無致病性禽流感病毒3大類[2]。H9N2亞型為低致病性禽流感病毒，首次由Hommee等于1966年從火雞體內(nèi)分離得到[3]，之后在1994年，陳伯倫等首次在病死雞中分離得到該病毒[4]。我國于1998年起進行H9N2防治，但帶毒野禽的遷徙和活禽的市場交易加大了防控難度，病毒出現(xiàn)跨種傳播及重排現(xiàn)象，不僅在禽類中廣泛流行，而且在1999年從感冒兒童體內(nèi)分離到H9N2，后來又有5例該病毒感染人的報道[5]。

H9N2在鴨群中很少引起發(fā)病，在臨床上多不出現(xiàn)癥狀，但鴨群可長期帶毒或排毒，對AIV的發(fā)生及傳播起到了非常重要的作用。最新研究證明，H9N2亞型AIV在家禽中短期傳播后，可突變成致病性高的病毒[6]。因此，建立快速、便捷的診斷方法對該病的預(yù)防和控制極其重要。H9N2亞型禽流感病毒傳統(tǒng)的檢測方法主要是通過雞胚接種分離病毒，結(jié)合血凝抑制試驗檢測。該方法敏感性高，但耗時費力，不能滿足養(yǎng)殖場快速診斷的要求。本試驗以已知的紅血球凝聚素(hemagglutinin，簡稱HA)蛋白基因為目標(biāo)，建立了快速、敏感并且廉價的RT-PCR檢測方法，有望研發(fā)后在臨床中作為試劑盒推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

鴨低致病性禽流感病毒，由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院饋贈；鴨坦布蘇病毒、鴨瘟病毒、Ⅰ型鴨肝炎病毒、番鴨細(xì)小病毒，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所饋贈；鴨呼腸孤病毒毒株，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈。9～11日齡無特定病原體(SPF)雞胚，購自揚州朝天歌農(nóng)牧科技有限公司；dNTPs、RNA酶抑制劑、病毒提取試劑盒、PCR酶、DNA marker，均購自TaKaRa公司；MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自BBI公司；病毒基因組提取試劑盒，購自TaKaRa Bio公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、注射器、移液管、指形管和石蠟，均為市售。

1.2 病毒擴增

按1 ∶10、1 ∶100、1 ∶1 000體積比例PBS稀釋H9N2禽流感病毒原液，從尿囊腔無菌接種至9～11日齡SPF雞胚，每枚雞胚接種0.1 mL。37 ℃孵化72 h后全部死亡，4 ℃放置12 h后，收取尿囊液，放至于-80 ℃保存。

1.3 病毒RNA提取

取上述收集的尿囊液100 μL，按照病毒基因組提取試劑盒說明書進行RNA提取，提取時未加入Carrier RNA。最后將RNA溶解于40 μL RNase free dH2O中，分光光度儀測定病毒基因組的純度與濃度。

1.4 RT-PCR方法的建立

根據(jù)已發(fā)表的HA蛋白基因序列(登錄號：AY790315.1)設(shè)計1對引物。上游引物F：5′-CAAACTCCACAGAAACTG-3′，下游引物R：5′-CTGACATTGTGGAATGGC-3′。設(shè)置 25 μL 反應(yīng)體系進行反轉(zhuǎn)錄，包含反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、dNTPs 2 μL、Random Primer 2 μL、5×RT buffer 5 μL、抑制劑0.5 μL和RNA模板14.5 μL，反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min。

PCR采用50 μL反應(yīng)體系，包含cDNA產(chǎn)物5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2 ×Taqmix酶25 μL，水18 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，進行25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。同時設(shè)無RNA的空白對照組。

1.5 特異性測定

按病毒基因組提取試劑盒說明書，分別提取H9N2病毒、鴨瘟病毒、Ⅰ型鴨肝炎病毒、鴨呼腸孤病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨坦布蘇病毒基因組，用H9N2的上、下游引物分別進行 RT-PCR 擴增，取擴增產(chǎn)物5 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 敏感性測定

取1 μL提取的RNA作10倍梯度稀釋，按照上述反轉(zhuǎn)錄及PCR程序進行擴增，后取擴增產(chǎn)物5 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.7 臨床樣品檢測

應(yīng)用建立的RT-PCR方法，對江蘇泰州、南通和徐州等地的5份疑似AIV病毒感染的鴨肝臟組織進行檢測，檢測時設(shè)不加RNA的空白對照組與H9N2 AIV陽性對照組，擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂凝膠電泳分析，并將特異性擴增條帶切膠回收后，送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組的提取

按照病毒基因組提取試劑盒說明書進行RNA提取后，用分光光度儀測定病毒基因組濃度為11.9 ng/μL。

2.2 檢測方法的建立

病毒基因組經(jīng)42 ℃ 1 h反轉(zhuǎn)錄后，94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃ 變性 30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min(25個循環(huán))；72 ℃延伸10 min，在1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中可見清晰條帶(圖1)，該條帶與預(yù)期837 bp目的片段相符。

2.3 特異性測定

在同等反應(yīng)條件下，以H9N2上、下游引物對H9N2、鴨瘟病毒、Ⅰ型鴨肝炎病毒、鴨坦布蘇病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨呼腸孤病毒基因組進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，由圖2可見，僅H9N2擴增出預(yù)期大小片段，而其他對照病原均未擴增出任何目的條帶。

2.4 敏感性測定

在同等反應(yīng)條件下，以1 μL RNA為起始劑量，經(jīng)10倍梯度稀釋后作為模板，進行擴增，在稀釋了107之后無特異性條帶，對應(yīng)RNA約為1 fg，結(jié)果見圖3。

2.5 臨床樣品的測定

用建立的方法檢測臨床采集的5份疑似病料，均在預(yù)期的837 bp處有特異性擴增，而空白對照組無擴增條帶，檢出率為100%，檢測結(jié)果見圖4。5個擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果與HA蛋白基因序列(登錄號：AY790315.1)同源性為100%。

3 討論

禽流感一年四季均可發(fā)生，但以春季流行為主，可感染人、豬、馬、海洋哺乳動物、禽類等，其中遷棲水禽，尤其是鴨，產(chǎn)生的病毒比其他禽類要多。水禽感染后一般不表現(xiàn)出臨床癥狀，但可長期帶毒和排毒，研究表明，水禽糞便中的病毒滴度相當(dāng)高，病毒通過糞便將病毒排到水中，形成一個傳播鏈：糞便—水—口[5]。水禽不僅通過間接方式傳播病毒，而且可作為AIV變異和重組的混合器，各種亞型的禽流感病毒均可從鴨體內(nèi)分離到[5-6]。

H9N2亞型禽流感病毒是A型流感病毒的一個亞型，其系譜復(fù)雜，流行范圍廣，是我國禽流感的主要亞型，其致病性較低，但可在水禽體內(nèi)發(fā)生重組，改變其抗原和宿主的特異性，對養(yǎng)殖業(yè)和人類均可帶來潛在的危害。Liu等于2014年提出H9N2為新型人流感提供了溫床的概念[7]。因此，建立一種快速有效的診斷方法對禽流感病毒傳播的控制顯得尤為重要。對于該病的診斷，傳統(tǒng)的方法主要針對病毒抗體的檢測，有瓊脂擴散試驗、血凝抑制試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等，傳統(tǒng)的檢測方法雖然重復(fù)性好，敏感性強，但耗時費力。目前，國外已建立以HA蛋白為基礎(chǔ)的H5、H7亞型特異性RT-

PCR診斷技術(shù)[5]。筆者所在實驗室以H9N2的HA蛋白為基礎(chǔ)，比對鴨瘟病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨坦布蘇病毒、番鴨細(xì)小病毒和Ⅰ型鴨肝炎病毒相關(guān)基因的序列，最終根據(jù)AY790315.1序列選取了苷酸序列同源性較高的長837 bp的保守序列作為靶序列，成功建立了一種特異性強、敏感性高、重復(fù)性好、操作簡單的H9N2禽流感病毒RT-PCR檢測方法，普遍適用于臨床上H9N2感染樣品(如內(nèi)臟混合物、泄殖腔試紙、鼻試紙等)的快速檢測，對預(yù)防和控制H9N2亞型禽流感病毒的流行具有積極的科學(xué)意義。

[1]王金良，李旭勇，范 俊，等.H9N2亞型禽流感病毒的序列分析及對哺乳動物致病力研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2013，35(8)：663-665.

[2]甘孟侯.禽流感[M].2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[3]Homme P J，Easterday B C.Avian influenza virus infections.Ⅰ.Characteristics of influenza A-turkey-Wisconsin-1966 virus[J].Avian Diseases，1970，14(1)：66-74.

[4]陳伯倫，張澤紀(jì)，陳偉斌.禽流感研究Ⅰ：雞A型禽流感病毒的分離與血清學(xué)初步鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，1994，20(10)：3-5.

[5]李 銀.禽流感病毒H9N2鴨分離株的生物學(xué)與分子生物學(xué)特性及其快速診斷的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[6]葛菲菲，劉 健，楊德全，等.上海市三株H9N2鴨禽流感病毒全基因遺傳進化分析[J].中國動物傳染病學(xué)報，2014，22(5)：15-20.

[7]Liu D，Shi W F，Gao F G.Poultry carrying H9N2 act as incubators for novel human avian influenza viruses[J].Lancet，2014，383(9920)：869.