黃秋葵嫩莢粗多糖的抗氧化活性研究

周志航，蘇文浩

（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳 518055）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus），又有名洋芝麻、羊角豆、洋辣椒、補腎草等。黃秋葵原產(chǎn)自非洲東部地區(qū)，于20世紀90年代引入我國種植，由于生長周期短、耐干旱的特性，隨著近年來推廣普及工作的開展，已經(jīng)在我國廣東、福建、云南、海南和山東等多個地區(qū)開始種植栽培。黃秋葵含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，被多個國家地區(qū)評定為綠色食品，在崇尚食療和藥食同源概念流傳已久的中國，是一種價值極高的藥食兩用蔬菜。

雖然黃秋葵的嫩花與葉子也可以食用，但黃秋葵最有食用價值的是黃秋葵嫩莢。除了日常的涼拌和炒食以外，國外還將其應(yīng)用于低脂巧克力、餅干等的制作。黃秋葵嫩莢中蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)、維生素的含量非常豐富，經(jīng)相關(guān)研究證實，F(xiàn)e，P，K，Se等元素存在于新鮮的黃秋葵嫩莢中且含量高于其他植物，這些微量元素對于人體有著重要的特殊作用[1]。

黃秋葵具有利咽、通淋、預(yù)防和治療腸胃炎癥等入藥功能，在黃秋葵嫩莢的黏液中，科學(xué)家研究并發(fā)現(xiàn)了一種叫做Lepidimoide（簡稱LM） 的物質(zhì)[2]，其性質(zhì)類似天然荷爾蒙，在某種層面上，被稱為咖啡黃葵的黃秋葵與咖啡起到同樣的效果，能夠幫助機體有效對抗疲勞。不僅如此，黃秋葵還有改善感到疲勞時的恢復(fù)力和對抗疲勞的能力，同時還具有提高動物的耐力、耐缺氧、耐寒與耐熱能力的效果，甚至對男性性功能障礙起到輔助治療的效果，這也是為什么人們會把黃秋葵稱為“奧運蔬菜”“植物偉哥”的部分緣由。更加讓人感到驚喜的是，黃秋葵除了可以作為天然的興奮劑外，黃秋葵嫩莢中的組分中還有起到鎮(zhèn)靜催眠效果的組分[3]，若是朝著這個方向深入開展研究，或許不久后失眠人士便可以將藥物助眠改為食療。新鮮的黃秋葵還能起到保護視力、舒緩眼睛疲勞、改善近視狀況的作用，是因為其中包含了胡蘿卜素和VA，嫩莢里Zn和Se等微量元素同秋葵含有的黃酮類物質(zhì)一起參與人體內(nèi)分泌，可達到恢復(fù)內(nèi)分泌平衡的效果。另外，還有研究表明黃秋葵除了在降血脂、降血壓方面也能發(fā)揮一定作用外，還具有抗糖尿病和高血脂的藥效[4-5]。

因為黃秋葵自身蘊含的豐富營養(yǎng)物質(zhì)本就具有研究意義，加上近些年生活水平有了大幅度的提升，人們對健康飲食也愈發(fā)看重。近年來，專家學(xué)者都開始把求知的熱忱投向黃秋葵這一尚待開發(fā)的領(lǐng)域。目前，國內(nèi)外絕大多數(shù)的研究成果集中在黃秋葵的農(nóng)業(yè)種植培育條件的探索、果實外觀形態(tài)和保藏、營養(yǎng)成分測定[6]、目的組分提取條件等方面，如秋葵多糖提取工藝的研究[7]，或是在醫(yī)藥方面研究黃秋葵對于血糖、血脂、癌癥等現(xiàn)代常見疾病的對抗效果[8-9]。現(xiàn)今國內(nèi)外的主要想法仍停留在將黃秋葵作為食材利用，對于黃秋葵生物活性物質(zhì)的研究還不多。試驗利用熱水浴法和微波超聲協(xié)助法提取黃秋葵嫩莢中的粗多糖，并對其抗氧化活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵嫩莢，購于深圳市西麗天虹超市。

無水乙醇、葡萄糖、抗壞血酸、苯酚、濃硫酸、過硫酸鉀，以及DPPH和ABTS均為分析純。

1.2 儀器

ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機，德國Christ公司產(chǎn)品；A11小型粉碎機，德國IKA公司產(chǎn)品；馬頭牌電子天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；MSNew Classic型電子分析天平，Mettler Toledo公司產(chǎn)品；加熱磁力攪拌器，VELPScientifica產(chǎn)品；DKS22型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CW-2000型超聲微波協(xié)助萃取/反應(yīng)儀，上海新拓分析儀器科技有限公司產(chǎn)品；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機，德國 Eppendorf公司產(chǎn)品；上分-L6型紫外可見分光光度計，上海儀電公司產(chǎn)品；微量移液器，Eppendrof公司產(chǎn)品；雙華牌DK-20型超級循環(huán)水浴磁力攪拌器，金壇市文華儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃秋葵嫩莢粗多糖的提取方法

將黃秋葵嫩莢洗凈、晾干，剖成合適大小，冷凍干燥。取凍干的黃秋葵嫩莢置于攪拌機中，加入80%乙醇打漿、過濾，濾渣烘干后用粉碎機粉碎，制得黃秋葵嫩莢干粉，置于陰涼干燥條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

（1）熱水浴法提取黃秋葵嫩莢粗多糖。分別稱取黃秋葵嫩莢干粉，按照料液比1∶30，1∶40，1∶50加入蒸餾水，放入磁力轉(zhuǎn)子，用保鮮膜包裹后分別放置于60，70，80℃的電熱恒溫水浴鍋中，開啟磁力攪拌，水浴2 h。2 h過后取出混合液，冷卻至室溫后分裝，于轉(zhuǎn)速10 000 r/min，4℃條件下離心10min，取上清液。在攪拌條件下加入3倍體積的無水乙醇，混勻，于4℃下放置過夜后，于轉(zhuǎn)速10 000 r/min，4℃條件下離心5 min，取沉淀。揮干乙醇后用冷凍干燥，得到黃秋葵嫩莢粗多糖。

（2）微波超聲協(xié)助法提取黃秋葵嫩莢粗多糖。分別稱取黃秋葵嫩莢干粉，按照料液比1∶30，1∶40，1∶50加入蒸餾水，轉(zhuǎn)入特制的超聲瓶后，放入超聲微波協(xié)同萃取儀中，設(shè)置溫度上限為60℃，并將微波功率分別設(shè)置為100，200，300W，超聲時間20min。超聲后取出混合液待其冷卻至室溫后分裝，于轉(zhuǎn)速10 000 r/min，4℃條件下離心10 min，取上清液，在攪拌條件下加入3倍體積的無水乙醇，混勻，于4℃條件下放置過夜。于轉(zhuǎn)速10 000 r/min，4℃條件下離心5 min，取沉淀，揮干乙醇后冷凍干燥，得到黃秋葵嫩莢粗多糖。

1.3.2 黃秋葵嫩莢粗多糖得率的測定

將冷凍干燥的黃秋葵嫩莢粗多糖稱質(zhì)量，計算黃秋葵嫩莢粗多糖的得率，計算公式如下：

1.3.3 黃秋葵嫩莢粗多糖含量的測定

黃秋葵嫩莢粗多糖質(zhì)量濃度的測定參照魏紹云等[10]的方法。

精密稱取葡萄糖標準品100 mg，加入蒸餾水溶解，完全溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻后取10mL轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，同樣加入蒸餾水定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準母液。分別精確吸取葡萄糖標準母液100，200，300，400，500，600μL分別置于試管中，加蒸餾水稀釋至1 mL，吸取200μL到試管，分別加入200μL的5%苯酚溶液，搖勻，然后加入1 mL濃硫酸，混勻，置于30℃水浴20 min，冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。

精密稱取20mg的粗多糖置于研缽中研磨成粉，加入蒸餾水溶解，制成粗多糖黏溶液，準確吸取粗多糖黏溶液1 mL于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻備用，此為粗多糖工作液。準確吸取200μL粗多糖工作液置于試管中，準確吸取5%苯酚溶液200μL加入試管，搖勻，緩慢加入1 mL濃硫酸混勻，置于30℃水浴20 min，冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光度，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算粗多糖含量。

1.3.4 清除DPPH自由基能力的測定[11]

吸取粗多糖黏溶液，稀釋至質(zhì)量濃度為1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 mg/mL的多糖工作液，然后準確吸取200μL不同質(zhì)量濃度樣品溶液分別加入1 mL的0.1μmol/L DPPH溶液中，充分混勻，于室溫避光保存30min后在波長517 nm處測定吸光度。空白組用1 mL乙醇替代DPPH·溶液，對照組中取200μL乙醇替代樣品溶液，在波長517 nm處對樣品測定吸光度，平行3次取平均值。以抗壞血酸作為標準抗氧化劑。計算DPPH自由基的清除率，并計算IC50的值。

式中：A0——200μL乙醇和1mL的0.1μmol/LDPPH溶液的混合液在波長517nm處的吸光度；

Ai——200μL樣品溶液和1mL的0.1μmol/L DPPH·溶液的混合液在波長517 nm處的吸光度；

Aj——200μL樣品溶液和1mL乙醇的混合液在波長517 nm處的吸光度。

1.3.5 清除ABTS+自由基能力的測定[12]

吸取粗多糖黏溶液，將稀釋至質(zhì)量濃度為1.0，0.8，0.6，0.4，0.2mg/mL的多糖工作液，精準吸取各濃度工作液50μL分別加入1mL的ABTS+·混合液中，充分混勻，置于室溫避光保存30min后在734 nm處測定吸光度。此外，另取50μL乙醇重復(fù)以上操作，作為空白對照試驗，在波長734 nm處對樣品測定吸光度，平行3次取平均值?？箟难嶙鳂藴士寡趸瘎?。計算ABTS+自由基的清除率，并計算IC50值。

式中：A0——空白組的吸光度；

At——樣品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-濃硫酸法測黃秋葵嫩莢粗多糖質(zhì)量濃度標準曲線

用葡萄糖作為標準品制作的標準曲線，回歸方程為Y=11.993X+0.031 6，R2=0.999 7。

苯酚-濃硫酸法測黃秋葵嫩莢粗多糖質(zhì)量濃度標準曲線見圖1。

圖1 苯酚-濃硫酸法測黃秋葵嫩莢粗多糖質(zhì)量濃度標準曲線

由圖1可知，在黃秋葵嫩莢粗多糖質(zhì)量濃度0.01～0.06mg/mL的范圍內(nèi)吸光度與葡萄糖質(zhì)量濃度有著良好的線性關(guān)系。

2.2 不同參數(shù)對熱水浴提取黃秋葵嫩莢粗多糖得率的影響

不同參數(shù)條件下熱水浴提取黃秋葵嫩莢粗多糖的得率見表1。

表1 不同參數(shù)條件下熱水浴提取黃秋葵嫩莢粗多糖的得率

由表1可知，在相同的提取溫度條件下，黃秋葵嫩莢粗多糖得率在料液比1∶40時達到最大值，且隨著提取溫度的升高而上升。

2.3 不同參數(shù)對超聲微波協(xié)同提取黃秋葵嫩莢粗多糖得率的影響

不同參數(shù)條件下超聲微波協(xié)同提取黃秋葵嫩莢多糖的得率見表2。

表2 不同參數(shù)條件下超聲微波協(xié)同提取黃秋葵嫩莢粗多糖的得率

由表2可知，相同的微波功率作用下，粗多糖得率與料液比呈正相關(guān)，隨著料液比的增大而提高。在功率大小不同的組間，微波功率為200W時最高。

2.4 不同參數(shù)條件下熱水浴提取的粗多糖DPPH自由基清除能力

不同參數(shù)條件下熱水浴提取黃秋葵嫩莢多糖對DPPH自由基清除結(jié)果見表3。

表3 不同參數(shù)條件下熱水浴提取黃秋葵嫩莢粗多糖對DPPH自由基清除結(jié)果

由表3可知，黃秋葵嫩莢粗多糖清除DPPH自由基的能力隨著質(zhì)量濃度的減少呈明顯下降趨勢，具有一定的量效關(guān)系。相同提取溫度下，加大料液比提取的黃秋葵嫩莢粗多糖對DPPH自由基的清除能力也有提升。隨著提取溫度的上升，提取的黃秋葵嫩莢粗多糖對DPPH自由基的清除率明顯升高。

2.5 不同參數(shù)條件下超聲微波協(xié)同提取的黃秋葵嫩莢粗多糖對DPPH自由基清除能力

不同參數(shù)條件下超聲微波協(xié)同提取的黃秋葵嫩莢粗多糖對DPPH自由基清除結(jié)果見表4。

表4 不同參數(shù)條件下超聲微波協(xié)同提取的黃秋葵嫩莢粗多糖對DPPH自由基清除結(jié)果

由表4可知，黃秋葵嫩莢粗多糖清除DPPH自由基能力和表3的趨勢一致，隨著質(zhì)量濃度的減少而呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，存在量效關(guān)系。黃秋葵嫩莢粗多糖提取物對DPPH自由基的清除能力受微波功率變化的影響明顯，功率越高，DPPH自由基清除能力越強。

2.6 不同提取方法提取的黃秋葵嫩莢粗多糖清除DPPH自由基的IC50值

為了直觀地呈現(xiàn)樣品組別之間的差異，引入IC50值，IC50值越小對應(yīng)的抗氧化能力越強[13]。

不同參數(shù)條件下黃秋葵嫩莢粗多糖清除DPPH自由基的IC50值見圖2。

圖2 不同參數(shù)條件下黃秋葵嫩莢粗多糖清除DPPH自由基的IC50值

由圖2可知，抗壞血酸清除DPPH自由基能力較為出色，其IC50值為23.81μg/mL。微波超聲協(xié)助法和熱水浴法提取的黃秋葵嫩莢多糖隨著料液比的增大，對于DPPH自由基的清除能都在逐漸增強，但熱水浴法所提取的多糖在清除DPPH自由基方面的效果略差于微波超聲協(xié)助提取的多糖。

2.7 不同參數(shù)條件下熱水浴提取的多糖ABTS+自由基清除能力

不同參數(shù)條件下熱水浴提取黃秋葵嫩莢粗多糖的ABTS+自由基清除能力結(jié)果見表5。

表5 不同參數(shù)條件下熱水浴提取黃秋葵嫩莢粗多糖的ABTS+自由基清除能力結(jié)果

由表5可知，熱水浴提取的黃秋葵嫩莢粗多糖對ABTS+自由基清除率隨粗多糖質(zhì)量濃度的提高而提高，對于ABTS+自由基的清除能力隨著料液比的增大而提升，隨著溫度的升高，提取所得的黃秋葵嫩莢粗多糖對ABTS+自由基的清除能力也有一定程度提升。

2.8 不同參數(shù)條件下微波超聲協(xié)助提取的黃秋葵嫩莢粗多糖ABTS+自由基清除能力

不同參數(shù)條件下微波超聲協(xié)助提取黃秋葵嫩莢粗多糖的ABTS+自由基清除能力結(jié)果見表6。

表6 不同參數(shù)條件下微波超聲協(xié)助提取黃秋葵嫩莢粗多糖的ABTS+自由基清除能力結(jié)果

由表6可知，隨著微波功率的提高，ABTS+自由基的清除能力也有明顯的變化，相同質(zhì)量濃度下范圍由18.33%提高至31.12%。對比表5可知，微波超聲協(xié)助提取的樣品對于ABTS+自由基的清除能力環(huán)比低于熱水浴提取的樣品。

2.9 不同提取方法提取的黃秋葵嫩莢粗多糖清除ABTS+自由基的IC50值

不同參數(shù)條件下黃秋葵嫩莢粗多糖清除ABTS+自由基的IC50值見圖3。

圖3 不同參數(shù)條件下黃秋葵嫩莢粗多糖清除ABTS+自由基的IC50值

由圖3可知，抗壞血酸對ABTS+自由基的清除效果也是十分出色，它對應(yīng)的IC50值為36.53μg/mL。在微波功率逐漸增大的過程中，微波超聲協(xié)助法出現(xiàn)了高點，熱水浴法則呈現(xiàn)出逐漸增強的趨勢。

3 結(jié)論與討論

研究表明黃秋葵粗多糖有明顯的抗氧化活性，而在黃秋葵葉子、花朵、果莢的抗氧化能力中，果莢的能力最為突出[14-15]，所以選擇黃秋葵的嫩莢作為研究對象，而DPPH自由基和ABTS+自由基能夠提供有效可信的評定結(jié)果，因此可通過測定對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力來確定黃秋葵嫩莢粗多糖更為合適的提取方法。

采用熱水浴法和微波超聲協(xié)助法對黃秋葵嫩莢粗多糖在多種參數(shù)條件下提取，測定其得率及其含量。結(jié)果顯示，熱水浴法所提取得到的粗多糖得率隨著料液比和提取溫度增大而增大；而對于微波超聲協(xié)助法而言，樣品中粗多糖得率則沒有呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，粗多糖得率的趨勢為先升高后降低，于微波200W處達到最高點，這可能與微波超聲容易導(dǎo)致粗多糖長鏈大分子斷裂隨后發(fā)生分解有關(guān)。除此以外，還測定了2種方法提取的粗多糖對于DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率，比較其清除自由基能力的差異。試驗結(jié)果表明，2種方法所提取出來的粗多糖對DPPH和ABTS+自由基都具有一定程度的清除能力，而且清除率與粗多糖質(zhì)量濃度有一定的相關(guān)性[16]，但微波超聲協(xié)助提取的粗多糖樣品對于ABTS+自由基的清除活性較低。綜合以上因素，考慮到場地、儀器設(shè)備、人員操作等要素，熱水浴法更合適提取黃秋葵嫩莢粗多糖。

此外，雖然黃秋葵嫩莢粗多糖提取物對DPPH和ABTS+自由基的清除能力明顯弱于抗壞血酸（這可能與黃秋葵嫩莢粗多糖提取物中多糖的含量要低于純的抗壞血酸有關(guān)），但黃秋葵嫩莢粗多糖提取物對于DPPH自由基和ABTS+自由基清除的IC50最低值分別為241.40，319.10μg/mL，其抗氧化性明顯，同時黃秋葵嫩莢粗多糖屬于天然無毒的抗氧化劑，因此具有繼續(xù)研究的價值。

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