響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基

陳 敏 ，洪家麗 ，雷雅婷 ，陳嵐彬 ，陳永芳 ，萬(wàn)旭志 ，龔世禹 ，劉藝琳 ，余曉丹 ，曾 峰 ， 劉 斌 ，3

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

真菌中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如真菌多糖、多肽、氨基酸、蛋白質(zhì)、生物堿、萜類化合物、色素類化合物、甾醇，還有核苷類物質(zhì)、酚、酯類、微量元素和維生素等[1]，是保健產(chǎn)品研究和開發(fā)的主要原料之一，其中金針菇以超高的保健價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值吸引人們的眼球。液體深層發(fā)酵是獲得食用菌菌絲體的主要方法，具有液體發(fā)酵周期短、工業(yè)化生產(chǎn)所需空間小、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)[2]，比子實(shí)體的培植更適合工業(yè)化生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，從液體發(fā)酵獲得金針菇菌絲體中提取的多糖有抗氧化[3-7]、提高免疫力[8-10]、抗腫瘤[5，11]等作用。在臨床試驗(yàn)中，食藥用菌菌絲體多糖類活性物質(zhì)無(wú)副作用[12]。菌絲體中的多糖含量也明顯高于子實(shí)體[13]，同時(shí)菌絲體多糖的抗氧化活性也大于子實(shí)體多糖[14]。目前，真菌液體發(fā)酵的研究主要集中于通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件的優(yōu)化來(lái)提高菌絲得率及其他代謝產(chǎn)物。果蔬汁中富含維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等，添加到培養(yǎng)基中作為氮和碳的補(bǔ)充來(lái)源，不僅有利于促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和改善風(fēng)味，還能極大地降低成本，擴(kuò)大工業(yè)生產(chǎn)。為了進(jìn)一步提高菌絲體得率，應(yīng)用響應(yīng)面分析法，以金針菇菌絲生物量作為優(yōu)化響應(yīng)值，通過(guò)葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和果蔬汁對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期為食用菌液體發(fā)酵果蔬汁提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

金針菇菌株，福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心提供，每2個(gè)月傳代1次，于4℃條件下保藏。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；101-3A型烘箱，廣州科域新材料科技有限公司產(chǎn)品；SKY-2102C型立式雙層低溫?fù)u床，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；SHZ-D III型循環(huán)水真空泵，鞏義市予化儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基

果蔬汁：胡蘿卜汁與梨汁比例為1∶1；金針菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，果蔬汁10%（V/V），pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 液體菌種的制備

選取經(jīng)過(guò)活化后的金針菇菌種制備液體菌種。在250 mL的三角瓶中裝入100 mL的液體培養(yǎng)基，使用一次性接種針勾取0.5 cm2大小的菌種接種于瓶中，重復(fù)操作接種5～6次，最后用脫脂棉塞封住三角瓶口，調(diào)整旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，在25℃的條件下振蕩培養(yǎng)三角瓶7 d，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

取第1步中振蕩培養(yǎng)完成的菌種作為一級(jí)菌種，使用一次性接種針接種于100 mL的液體培養(yǎng)基中，接種量10%，繼續(xù)在200 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上于25℃的條件下培養(yǎng)7 d，根據(jù)響應(yīng)面分析法中Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的原理，采用Design-Expert（Version 8.0.6.1）分析軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)[15-16]。以菌絲體干質(zhì)量為考查指標(biāo)，確定各因素對(duì)菌絲體影響的顯著性和液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳條件。

金針菇液體發(fā)酵試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。

表1 金針菇液體發(fā)酵試驗(yàn)因素水平及編碼/%

1.2.3 測(cè)定方法

菌絲生物量：取發(fā)酵液在4℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10min，收集沉淀物，去離子水洗滌3次，置于已稱質(zhì)量的干凈培養(yǎng)皿上，于真空干燥箱中在60℃條件下烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量2次差距不超過(guò)0.2mg即為菌絲生物量[17]。

2 結(jié)果與分析

采用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken設(shè)計(jì)法，以深層發(fā)酵得到的菌絲生物量為指標(biāo)，對(duì)金針菇菌絲體生長(zhǎng)過(guò)程中液體果蔬培養(yǎng)基的各組分進(jìn)行優(yōu)化研究。第4，8，9，11次試驗(yàn)為中心點(diǎn)試驗(yàn)，用于考查模型的誤差。其中，第21組菌絲生物量最少，為8.175 mg/mL；第 24組菌絲生物量最多，為21.335mg/mL。

響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)金針菇發(fā)酵試驗(yàn)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)金針菇發(fā)酵試驗(yàn)及結(jié)果

2.1 金針菇菌絲生物量方差分析結(jié)果

采用 Design-Expert（Version 8.0.6.1） 分析軟件對(duì)表2中金針菇菌絲生物量的各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，建立四元二次響應(yīng)面回歸模型：

金針菇發(fā)酵菌絲生物量方差分析結(jié)果見表3。

表3 金針菇發(fā)酵菌絲生物量方差分析結(jié)果

由表3可知，回歸項(xiàng)中p＜0.001，說(shuō)明所選擇模型非常顯著。失擬項(xiàng)p=0.193 1＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)差異并不顯著，表明該二次回歸模型能夠較顯著擬合葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和果蔬汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌絲生物量的影響，該模型可替代試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。其中，模型一次項(xiàng)蛋白胨和果蔬汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌絲生物量影響十分顯著，葡萄糖和KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌絲生物量影響顯著；模型二次項(xiàng)葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌絲生物量影響十分顯著，果蔬汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌絲生物量影響顯著。

2.2 金針菇菌絲生物量響應(yīng)面分析結(jié)果

對(duì)葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、KH2PO4（C）、果蔬汁（D）4個(gè)因素進(jìn)行交互作用分析。

各因素對(duì)金針菇菌絲生物量影響三維響應(yīng)曲面見圖1。

從圖1可以非常直觀地看出，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，隨著葡萄糖、蛋白胨和果蔬汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，金針菇菌絲生物量也在增加。葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、KH2PO4（C）、果蔬汁（D） 4個(gè)因素之間兩兩相互作用等高線均為橢圓，說(shuō)明這4個(gè)因素兩兩之間交互作用明顯。

圖1 各因素對(duì)金針菇菌絲生物量影響三維響應(yīng)曲面

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

金針菇深層液體發(fā)酵試驗(yàn)中，最優(yōu)培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為葡萄糖2.15%，蛋白胨0.38%，KH2PO40.27%，果蔬汁12.90%；在此條件下，優(yōu)化后的培養(yǎng)基中菌絲體實(shí)際含量為21.46mg/mL，與預(yù)測(cè)值21.51mg/mL相近，說(shuō)明預(yù)測(cè)值和實(shí)際值有較高的擬合性，工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

深層液體發(fā)酵是近年來(lái)生產(chǎn)食用菌菌絲體的主要方法之一，已經(jīng)成為研究食用菌保健制品的重要手段，因此食用菌的開發(fā)利用已經(jīng)由以往的大棚子實(shí)體栽培慢慢向深層發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)展，為食藥用菌的研發(fā)帶來(lái)巨大利益和便利[18]。為了提高液體發(fā)酵金針菇菌絲體的得率，通常對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，目前食藥用菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基提高菌絲體得率的優(yōu)化主要集中在氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽、溫度、pH值等方面[19-20]。試驗(yàn)以葡萄糖作為碳源，蛋白胨作為氮源，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)添加經(jīng)濟(jì)易得的果蔬汁來(lái)發(fā)酵食用菌，利用響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基配方以研究對(duì)菌絲體得率的影響。通過(guò)分析，得出最優(yōu)培養(yǎng)基配方為葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.15%，蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.38%，KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.27%，果蔬汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.9%。依據(jù)響應(yīng)面分析調(diào)整培養(yǎng)基配方后實(shí)際測(cè)定值為21.46mg/mL，與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明預(yù)測(cè)值和實(shí)際值有較高的擬合性，工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

通過(guò)對(duì)金針菇菌絲營(yíng)養(yǎng)特性的研究可以明顯發(fā)現(xiàn)，速效性和遲效性的碳源或氮源，以及無(wú)機(jī)鹽和維生素等都會(huì)對(duì)菌絲生物量產(chǎn)生影響。國(guó)內(nèi)在金針菇的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通常選擇添加黃豆粉、可溶性淀粉[21]等直接補(bǔ)充基礎(chǔ)的碳源和氮源。果蔬汁中富含單糖、礦物質(zhì)和VC等均易被人體吸收[22]，可以在保證金針菇生長(zhǎng)所需的碳源和氮源的同時(shí)進(jìn)一步提供各類其他營(yíng)養(yǎng)素，促進(jìn)菌絲體的生長(zhǎng)。同時(shí)，深層液體發(fā)酵后的果蔬汁培養(yǎng)基中富含氨基酸、多糖、無(wú)機(jī)酸等多種活性成分，不僅風(fēng)味獨(dú)特，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，可以后續(xù)開發(fā)利用，在批量化生產(chǎn)食用保健品中占有很大優(yōu)勢(shì)。

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