丹參川芎嗪注射液細菌內(nèi)毒素檢查法研究

張馨 梅群 肖植國

摘 ? 要：目的 ?建立丹參川芎嗪注射液細菌內(nèi)毒素檢查法。方法 ?依據(jù)《中國藥典》2015年版四部（通則1143）細菌內(nèi)毒素檢查法，通過預(yù)干擾預(yù)試驗和干擾試驗，確定丹參川芎嗪注射液最大無干擾的濃度，并進行方法學驗證。結(jié)果 ?將丹參川芎嗪注射液稀釋20倍，對細菌內(nèi)毒素檢測法無干擾作用。結(jié)論 ?丹參川芎嗪注射液內(nèi)毒素檢查法可用于檢查丹參川芎嗪注射液。

關(guān)鍵詞：丹參川芎嗪注射液;細菌內(nèi)毒素檢查;凝膠法;干擾試驗

中圖分類號：R286 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.24.041

文章編號：1006-1959（2018）24-0139-04

Abstract：Objective ?Establish a bacterial endotoxin test for Salviae Miltiorrhizae and Ligustrazine Hydrochloride. Methods ?According to the Chinese Pharmacopoeia's 2015 edition of the four-part （General Rule 1143） bacterial endotoxin test， the maximum interference-free concentration of ?Salviae Miltiorrhizae and Ligustrazine Hydrochloride was determined by pre-interference pre-test and interference test， and the methodological verification was carried out. Results ?The Salviae Miltiorrhizae and Ligustrazine Hydrochloride was diluted 20 times， which had no interference effect on the bacterial endotoxin test. Conclusion ?The endotoxin test of ?Salviae Miltiorrhizae and Ligustrazine Hydrochloride can be used to check Salviae Miltiorrhizae and Ligustrazine Hydrochloride.

Key words：Salviae Miltiorrhizae and Ligustrazine Hydrochloride;Bacterial endotoxin test;Gel method;Interference test

丹參川芎嗪注射液為復(fù)方制劑，淺棕紅色澄明液體，用于閉塞性腦血管疾病，如腦供血不全，腦血栓形成腦栓塞及其他缺血性心血管疾病，如冠心病的胸悶、心絞痛、心肌梗塞、缺血性中風、血栓閉塞性脈管炎，收載在國家藥品西藥標準（化學藥品地標升國標第十二冊），執(zhí)行標準WS-10001-（HD-1138）-2002[1]，目前標準采用家兔法進行熱原檢查，該檢查方法所用家兔的飼養(yǎng)時間長，操作繁瑣，實驗結(jié)果受家兔的個體差異影響較大。而細菌內(nèi)毒素檢查法具有靈敏、快速、操作簡便、結(jié)果準確等優(yōu)點，為建立該品種細菌內(nèi)毒素檢查法的可行性研究提供理論參考。

1材料

1.1試劑與藥品 ?細菌內(nèi)毒素工作標準品（CSE）（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1607302，規(guī)格：10 EU/支）;鱟試劑（TAL）（湛江安度斯生物科技有限公司，標示靈敏度0.5 EU/ml，批號：1609021，規(guī)格：0.1 ml/支;標示靈敏度0.25 EU/ml，批號：1705041，規(guī)格：0.1 ml/支;湛江博康海洋生物有限公司，標示靈敏度0.5 EU/ml，批號：1607270，規(guī)格：0.1 ml/支;標示靈敏度0.25 EU/ml，批號：1708230，規(guī)格：0.1 ml/支）;細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1607050，規(guī)格：5 ml/支）;丹參川芎嗪注射液（貴州拜特制藥有限公司，批號：20160445、20161233、20170313，規(guī)格：5 ml/支）。

1.2儀器 ?BET-48G細菌內(nèi)毒素測定儀（天大天發(fā)科技有限公司）;ZH-2BLENDER渦式振蕩器（天津藥典標準儀器廠）;Transferpette移液器;AXYGEN帶過濾無內(nèi)毒素槍頭。

2方法與結(jié)果

2.1鱟試劑靈敏度的復(fù)核試驗 ?所用鱟試劑應(yīng)依法進行靈敏度復(fù)核，結(jié)果均應(yīng)符合規(guī)定。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值（λ），用BET水分別將CSE溶解并制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的細菌內(nèi)毒素標準溶液，每一個濃度的溶液做4管，用BET水做2支陰性對照管。按《中國藥典》2015年版四部（通則1143）[2，3]對TAL進行標示靈敏度復(fù)核。由表1可見，2個廠家生產(chǎn)的鱟試劑靈敏度均符合規(guī)定。

2.2內(nèi)毒素限值的計算 ?根據(jù)《中國藥典》2015年版四部（通則1143）的有關(guān)要求[2]，內(nèi)毒素限值（L）按以下公式計算：L=K/M。式中K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5 EU/（kg·h）;M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，根據(jù)說明書丹參川芎嗪注射液最大劑量為10 ml，中國人均體重按60 kg計算，M=10 ml/（60kg·1h）=0.167 ml/（kg·h），則L=30 EU/ml。因此，計算出本品的細菌內(nèi)毒素限值為每1 ml丹參川芎嗪注射液中含內(nèi)毒素應(yīng)<30 EU。

2.3干擾預(yù)實驗最大有效稀釋倍數(shù)的確定 ?按藥典標準中供試品最大稀釋倍數(shù)（MVD）計算公式：MVD=CL/λ[2]，C為供試品溶液的濃度，L為供試品溶液的內(nèi)毒素限值，MVD=CL/λ=1.0 ml/ml×30 EU/ml/0.50（EU）=60。

2.4干擾預(yù)試驗 ?為了確定丹參川芎嗪注射液在多大濃度下對細菌內(nèi)毒素（CSE）和鱟試劑（TAL）的反應(yīng)不存在干擾作用，首先進行干擾試驗的預(yù)實驗[4]。將3批丹參川芎嗪注射液用BET水分別稀釋5、10、20、40、60倍作為供試品系列（NPC），同時用上述每一個濃度的溶液制備成含1 EU/ml（2λ）濃度的內(nèi)毒素溶液作為供試品陽性對照系列（PPC）。用標示靈敏度（λ）為0.50 EU/ml的2個廠家的鱟試劑（TAL）分別與2個系列溶液反應(yīng)，每一稀釋度作2支。BET水作陰性對照（NC），加入2 λ濃度的內(nèi)毒素標準溶液作為陽性對照（PC），從表2可見丹參川芎嗪注射液存在干擾作用，稀釋20倍時，即不再對試驗產(chǎn)生干擾。

2.5干擾試驗 ?根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，在進行正式干擾試驗時選擇供試品的不干擾濃度為稀釋20倍。取3個批號的丹參川芎嗪注射液用BET水分別稀釋20倍，分別用稀釋20倍的供試品溶液和BET水稀釋細菌內(nèi)毒素標準品（CSE），制成含1.0、0.5、0.25、0.125 EU/ml 4種濃度內(nèi)毒素的系列溶液。分別與λ=0.5 EU/ml的鱟試劑（TAL）反應(yīng)，按照《中國藥典》2015年版四部通則1143的凝膠限度試驗法，進行干擾試驗，當陰性對照（NC）為陰性時，結(jié)果按公式ES=lg-1（∑Xs/4）和Et=lg-1（∑Xt/4）計算各系列反應(yīng)終點內(nèi)毒素濃度的絕對值。式中：Es為內(nèi)毒素標準對照系列溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值;Et為含內(nèi)毒素的供試品系列溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值;Xs和Xt分別為含和不含丹參川芎嗪注射液系列各反應(yīng)終點細菌內(nèi)毒素濃度的對數(shù)值。由表3可見，ES均在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，并且Et在0.5ES～2ES范圍內(nèi)，說明稀釋20倍的丹參川芎嗪注射液在此試驗條件下，對鱟試劑（TAL）與細菌內(nèi)毒素（CSE）之間的凝聚反應(yīng)無干擾作用，符合《中國藥典》2015年版四部（通則1143）的判斷標準。同時，可以確定丹參川芎嗪注射液對TAL無干擾的濃度>20倍，目前市售的鱟試劑（TAL）均可用于丹參川芎嗪注射液進行細菌內(nèi)毒素檢查。

2.6供試品細菌內(nèi)毒素檢測法的驗證 ?取3個批號的丹參川芎嗪注射液分別用BET水稀釋20倍，使用λ=0.25 EU/ml的2個廠家的鱟試劑進行細菌內(nèi)毒素檢查，并按要求做陽性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對照，3批丹參川芎嗪注射液的內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定，見表4。

3結(jié)論

3.1本文所有表格中“+”表示陽性，“-”表示陰性。其判斷標準是形成凝膠且倒轉(zhuǎn)180。不變形、不從管壁滑脫者為陽性;未形成凝膠或形成凝膠不堅固、變形并從管壁滑脫者為陰性。

3.2鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗主要考察鱟試劑靈敏度的標示值（λ）是否準確、人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規(guī)定[6]。

3.3不同批次供試品對不同廠家的鱟試劑的干擾程度可能存在不同，為了避免因鱟試劑造成的判斷失誤，在干擾預(yù)試驗中使用了兩個廠家的鱟試劑，對3個批次的丹參川芎嗪注射液進行凝膠限度法內(nèi)毒素檢查，結(jié)果顯示，兩個廠家生產(chǎn)的鱟試劑檢驗結(jié)果相同，同一廠家不同批次的供試品對鱟試劑的反應(yīng)結(jié)果也無差異，因此確定丹參川芎嗪注射液的最大不干擾濃度為稀釋20倍。

3.4在干擾實驗中，將供試品稀釋20倍，用兩個廠家的鱟試劑進行干擾驗證，結(jié)果顯示，Es均在0.5λ～2λ范圍，3個供試品的Et均在0.5Es～2Es范圍，確認在該濃度下供試品無干擾作用。

3.5在內(nèi)毒素限值確定為30 EU/ml情況下，用靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑按凝膠限度檢查法對3個批次供試品進行細菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合規(guī)定，表明丹參川芎嗪注射液可適用凝膠限度法進行細菌內(nèi)毒素檢查。

3.6采用凝膠限度檢查法檢查細菌內(nèi)毒素，符合《中國藥典》2015年版四部（通則1143）的標準，操作簡便，結(jié)果準確，可以用于質(zhì)量控制。

3.7《中國藥典》2015年版并未收錄丹參川芎嗪注射液，也無國家標準對其進行細菌內(nèi)毒素檢查。采用傳統(tǒng)的家兔法檢查熱原，成本高、時間長、影響因素多、靈敏度低。細菌內(nèi)毒素檢查法相比于家兔熱原檢查法，具有經(jīng)濟、快捷、靈敏和易于標準化的優(yōu)點，受到了現(xiàn)代藥品檢驗技術(shù)的青睞。因此，開展丹參川芎嗪注射液內(nèi)毒素檢查法的研究有著重要的實際意義。

3.8建議將丹參川芎嗪注射液質(zhì)量標準中的熱原檢查項改為細菌內(nèi)毒素檢查項，規(guī)定每1 ml丹參川芎嗪注射液中含內(nèi)毒素的量應(yīng)<30 EU。