• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    細(xì)葉百合LpAGD14基因的克隆與表達(dá)分析

    2018-03-04 18:18:16汪王田忠平蘇小霞楊柳慧周蘊(yùn)薇東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院黑龍江哈爾濱150000
    草業(yè)學(xué)報(bào) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:高爾基體細(xì)葉鱗莖

    汪王,田忠平,蘇小霞,楊柳慧,周蘊(yùn)薇(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱150000)

    GTP酶激活蛋白(GAPs)是一類調(diào)節(jié)蛋白質(zhì),是ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor,Arf)基因功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,能夠與小G蛋白α亞基結(jié)合,激活GTP酶活性,促使GTP水解成GDP,轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔罨癄顟B(tài)[1-2]。失活狀態(tài)的Arf會(huì)結(jié)合到高爾基體上轉(zhuǎn)變成活化態(tài)的ArfGTP,與ArfGAP結(jié)合作用于KDEL-跨膜受體,同時(shí)ArfGAP可以促使ArfGTP水解失活[3-4]。與ArlGTP(類ArfGTPase)不同,ArfGAPs不但能激活霍亂毒素還可以回復(fù)Arf。有研究表明ArfGAP基因主要定位在高爾基體上,參與蛋白質(zhì)在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間的轉(zhuǎn)運(yùn),對(duì)蛋白的分類篩選起到促進(jìn)作用,失活狀態(tài)的ARF1的內(nèi)源GTP酶會(huì)抑制高爾基體產(chǎn)生α-淀粉酶和液泡蛋白的共表達(dá)[5]。ArfGAPs作為一種外殼蛋白參與囊泡的形成,是囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的重要組成部分[6]。酵母細(xì)胞中GCS1和GLO3(ArfGAP)缺失突變體破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體間的囊泡運(yùn)輸,導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)積累,進(jìn)一步證實(shí) ArfGAP在囊泡運(yùn)輸中的重要作用[7]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn), 在動(dòng)物細(xì)胞中,ArfGAPs 參與物質(zhì)跨膜運(yùn)輸過(guò)程[8];此外,ArfGAPs在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂以及器官分裂等生物過(guò)程同樣發(fā)揮重要作用[9-10]。

    關(guān)于Arf參與植物休眠解除進(jìn)程僅在馬鈴薯(Solanumtuberosum)中有過(guò)報(bào)道[11]。ArfGAP同屬于Arf家族成員,且是高爾基體囊泡的重要組成部分,通過(guò)介導(dǎo)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)ArfGAP是否也能參與植物休眠調(diào)控研究尚屬空白。細(xì)葉百合(Liliumpumilum)地下鱗莖具有休眠特性,未解除休眠的鱗莖開(kāi)花質(zhì)量差甚至出現(xiàn)盲花現(xiàn)象。本研究從細(xì)葉百合鱗莖cDNA文庫(kù)中克隆得到LpAGD14基因,分子生物手段和組織形態(tài)觀察相結(jié)合,對(duì)闡明LpAGD14功能和作用機(jī)制具有重要意義,同時(shí)對(duì)采用基因工程解除植物休眠提供理論指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1植物材料 細(xì)葉百合鱗莖取自東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃。試驗(yàn)于2014年10月中旬選出完好無(wú)損傷的周徑在4~6 cm的鱗莖,用水清洗干凈,再用50%多菌靈可濕性粉劑1000倍液浸泡30 min后,清水漂洗干凈,晾干。最后用消毒的蛭石(濕度以手握成團(tuán)、放手散開(kāi)為度)混合拌勻,裝入塑料盆中,用保鮮膜封上(膜上打小孔以透氣),置于4 ℃ 冰箱中冷藏處理。低溫處理階段,以處理第0、30、60、90天樣品分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4時(shí)期,提取RNA,并合成cDNA文庫(kù)。

    1.1.2主要試劑和藥品 膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自于天根生化科技(北京)有限公司;熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒和高保真酶KOD-Plus-Neo購(gòu)自TOYOBO,克隆基因反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara,T載體PMD18-T購(gòu)自全式金公司,內(nèi)切酶KpnⅠ和SpeⅠ購(gòu)自NEB。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1細(xì)葉百合總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 采用改良的CTAB法提取細(xì)葉百合鱗莖總RNA[12],采用PrimeScripTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反轉(zhuǎn)錄cDNA,具體做法是Oligo dT Primer (1 μL)+dNTP (1 μL)+RNA (1 μL),補(bǔ)水至10 μL,65 ℃保溫5 min,迅速冷卻,上述體系加5×PrimeScrip Ⅱ Buffer (4 μL)+RNase Inhibitor (0.5 μL)+PrimeScrip Ⅱ Rtase (1 μL),補(bǔ)水至20 μL,經(jīng)42 ℃ 45 min;95 ℃ 5 min后迅速冷卻,即得到cDNA模板。

    1.2.2LpAGD14基因的克隆和序列分析 根據(jù)已獲得的該基因最大開(kāi)放閱讀框(ORF)序列設(shè)計(jì)特異性上下游引物L(fēng)pAGD14-F: ATGGCGAATCGGATGAAGGA和LpAGD14-R:AGCAAACCCC TTTGGGAAGA。進(jìn)行PCR擴(kuò)增,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆,以M13R為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。將獲得的序列采用Clustalx 1.83 軟件與已知的ORF序列進(jìn)行比對(duì),NCBI在線軟件BlastX進(jìn)行同源比對(duì)。利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);在線分析工具SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)和Pfam (Protein family: http://pfam.Sanger.ac.uk/)用于蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的分析;用Expasy (www.EXPASY.org)預(yù)測(cè)氨基酸相關(guān)理化性質(zhì)。利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)對(duì)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè),利用SOPMA對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

    1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因表達(dá)模式 以lilyActin[13](GenBank 登錄號(hào):JX826390)基因作為內(nèi)參基因,ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix (TOYOBO,Japan)反轉(zhuǎn)錄低溫貯藏4個(gè)時(shí)期總RNA (500 ng),所得cDNA稀釋5倍作為熒光定量模板。熒光染料采用SYBR Green (TOYOBO,Japan),在Roche LightCycler96上進(jìn)行如下反應(yīng):預(yù)變性(95 ℃ for 30 s);3步法(95 ℃ for 5 s;60 ℃ for 15 s;72 ℃ for 30 s;45 cycles);溶解(95 ℃ for 10 s;65 ℃ for 60 s;97 ℃ for 1 s);冷卻(37 ℃ for 30 s),每組3個(gè)重復(fù),以S1時(shí)期表達(dá)量為對(duì)照,LpAGD14的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算參考2-ΔΔCt[14]。

    1.2.4亞細(xì)胞定位分析基因表達(dá)位點(diǎn) 對(duì)測(cè)序正確的LpAGD14質(zhì)粒稀釋100倍作為模板,設(shè)計(jì)添加酶切位點(diǎn)KpnⅠ (NEB)和SpeⅠ (NEB)的特異性引物:LpAGD14-F:5′-GGTAC∨CATGGCGAATCGGATGAAG-3′和LpAGD14-R:5′-A∨CTAGTCCCAAAAGGGTTTCCTCC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),對(duì)加上酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒與帶有GFP綠色熒光蛋白報(bào)告基因的pBI121-MCS-GFP載體分別經(jīng)KpnⅠ+SpeⅠ雙酶切,酶切體系為:PMD18-T-LpAGD14 /pBI121-MCS-GFP (8 μL)+KpnⅠ(1 μL)+SpeⅠ(1 μL)+CutSmart Buffer (2 μL)+ddH2O (8 μL),37 ℃酶切20 min,1%瓊脂糖凝膠電泳回收后T4連接過(guò)夜,構(gòu)建pBI121-LpAGD14-GFP植物表達(dá)載體,經(jīng)鑒定后,以pBI121-MCS-GFP為對(duì)照,參考劉鍇棟等[15]的基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥(Aliumcepa)表皮細(xì)胞,經(jīng)過(guò)24 h的暗培養(yǎng),共聚焦顯微鏡觀察基因瞬時(shí)表達(dá)。

    1.2.5透射電子顯微鏡觀察高爾基體超微結(jié)構(gòu) 取冷藏處理4個(gè)時(shí)期的細(xì)葉百合鱗莖,通過(guò)固定、沖洗、脫水、滲透、包埋、切片、染色等步驟,電鏡樣品的制備具體參考劉芳等[16]的方法,H-7650透射電子顯微鏡下觀察不同時(shí)期高爾基體形態(tài)變化。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)葉百合基因LpAGD14的克隆及序列特征分析

    采用改良CTAB法提取RNA, 所得RNA 28S條帶亮度大約為18S兩倍,D260/D280介于1.8~2.0間,RNA效果較好,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板,獲得目的基因擴(kuò)增片段,獲得的拼接結(jié)果與已知ORF序列比對(duì),完全吻合。生物信息學(xué)分析表明,該編碼區(qū)大小為1923 bp,預(yù)測(cè)編碼一個(gè)含有640個(gè)氨基酸的蛋白。具有ArfGAP保守結(jié)構(gòu)域(圖1),該結(jié)構(gòu)域位于氨基酸序列的第12~130位,由119個(gè)氨基酸組成,屬于Arf基因家族,是一種GTPase。

    圖1 LpAGD14的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.1 The conserved domain prediction of LpAGD14

    2.2 LpAGD14基因氨基酸理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

    對(duì)基因編碼的氨基酸序列的組成成分和理化性質(zhì)分析結(jié)果表明,該蛋白的分子量約為69.43 kDa,理論等電點(diǎn)為8.95,氨基酸的親水指數(shù)為-0.733(正值:疏水;負(fù)值:親水),說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白??缒そY(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)顯示該蛋白的氨基酸肽鏈位于膜外,推測(cè)其可能不存在跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于非跨膜類蛋白。LpAGD14基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含有豐富的無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋,其次為延伸鏈和β-卷角。

    2.3 LpAGD14基因氨基酸同源性分析

    氨基酸同源性比對(duì)結(jié)果顯示該氨基酸序列與油棕(Elaeisguineensis)、芭蕉(MusaacuminatesubspMalaccensis)、海棗(Phoenixdactylifera)、鳳梨(Ananascomosus)等多種植物的GTP激活蛋白AGD14具有較高的同源性,都含典型的C4型鋅指結(jié)構(gòu),有4個(gè)固定的半胱氨酸(cysteine),即CX2CX16CX2C結(jié)構(gòu)域,分析其與不同物種的GTP激活蛋白AGD14進(jìn)化關(guān)系(圖2),其中與油棕(XP_010934816)GTP激活蛋白AGD14同源性達(dá)到59%,與其他植物的同源性均在40%以上,因此,將該細(xì)葉百合GTP酶激活蛋白命名為L(zhǎng)pAGD14(登錄號(hào):KY434115)。

    圖2 細(xì)葉百合及其他植物AGD14基因的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of AGD14 of lily and other plants

    2.4 LpAGD14基因表達(dá)模式分析

    圖3 LpAGD14基因在細(xì)葉百合鱗莖不同休眠時(shí)期的相對(duì)表達(dá)Fig.3 The relative expression of LpAGD14 gene in different dormancy stages of Lilium pumilum

    以百合肌動(dòng)蛋白基因lilyActin[13]為內(nèi)參基因,采用qRT-PCR法對(duì)細(xì)葉百合鱗莖低溫儲(chǔ)藏0 d(S1)、30 d(S2)、60 d(S3)、90 d(S4)鱗莖的LpAGD14基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析(圖3),結(jié)果表明,LpAGD14基因相對(duì)表達(dá)量在S2時(shí)期較前一時(shí)期增長(zhǎng)3倍,在S3時(shí)期較前一時(shí)期增長(zhǎng)2倍,在S4時(shí)期較前一時(shí)期增長(zhǎng)6倍,差異表達(dá)顯著。

    2.5 LpAGD14基因亞細(xì)胞定位分析

    共聚集顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),空載體質(zhì)粒打入洋蔥表皮后,綠色熒光分布于整個(gè)細(xì)胞中(圖4A),而重組融合載體pBI121-LpAGD14-GFP質(zhì)粒打入洋蔥表皮后,在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有較為明顯的綠色熒光,并且能同時(shí)檢測(cè)到多個(gè)洋蔥表皮細(xì)胞中出現(xiàn)綠色熒光(圖4B),說(shuō)明pBI121-LpAGD14-GFP融合亞細(xì)胞表達(dá)載體定位在細(xì)胞膜上。

    2.6 透射電子顯微鏡觀察高爾基體超微結(jié)構(gòu)

    高爾基體結(jié)構(gòu)在低溫貯藏不同時(shí)期具有較為明顯的變化(圖5)。在S1時(shí)期,高爾基體數(shù)量較少,分泌囊泡數(shù)量不多,基本分布為1~3層,到S2時(shí)期,可見(jiàn)高爾基體上分布3~5層扁平囊泡,隨低溫貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),在S3時(shí)期高爾基體結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,囊泡層數(shù)繼續(xù)增多,可以觀察到6~7層囊泡,并在S4時(shí)期進(jìn)一步增長(zhǎng)到8~10層,此時(shí)期正與鱗莖休眠解除相對(duì)應(yīng)。

    圖4 LpAGD14基因在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)Fig.4 Transient expression of LpAGD14 gene in onionA1, A2, A3: 瞬時(shí)表達(dá)pBI121-MCS-GPF的洋蔥表皮細(xì)胞作為對(duì)照,分別為熒光、白光和重疊視野。B1, B2, B3: 瞬時(shí)表達(dá)pBI121-LpAGD14-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞,分別為熒光、白光和重疊視野。A1, A2, A3:Transiently expressed pBI121-MCS-GPF in onion epidermal cells, fluorescent, bright and vision.B1, B2, B3:Transiently expressed pBI121-LpAGD14-GFP in onion epidermal cells, fluorescent, bright and vision.

    圖5 低溫貯藏時(shí)期細(xì)葉百合鱗莖高爾基體超微結(jié)構(gòu)的觀察Fig.5 Golgi bodies ultrastructure observation of Lilium pmnilmn during cold storagea, b, c 和 d分別代表低溫貯藏0、30、60、90 d高爾基體超微結(jié)構(gòu)。Cw: 細(xì)胞壁;G:高爾基體。a, b, c and d represent Golgi bodies ultrastructure during cold storage of 0, 30, 60 and 90 days, respectively. Cw: Cell wall; G: Golgi body.

    3 討論

    有研究表明,抑制馬鈴薯(Solanumtuberosum)Arf基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植物表型及碳水化合物含量發(fā)生變化[17],而淀粉及可溶性糖和相關(guān)酶活性的變化,能夠進(jìn)一步影響百合鱗莖所處的休眠狀態(tài)[18-19],推測(cè)Arf基因可能間接參與休眠進(jìn)程的調(diào)控。Liu等[11]從馬鈴薯中克隆得到Arf基因,熒光定量分析發(fā)現(xiàn),Arf基因表達(dá)量在馬鈴薯塊莖休眠解除后期顯著增長(zhǎng),Arf基因積極參與馬鈴薯塊莖休眠解除進(jìn)程。LpAGD14屬于Arf家族下的ArfGAP亞家族成員,在低溫解除細(xì)葉百合鱗莖休眠期間,其表達(dá)量顯著增長(zhǎng),LpAGD14基因的上調(diào)表達(dá)與鱗莖的休眠解除進(jìn)程相對(duì)應(yīng)。前人發(fā)現(xiàn),ArfGAPs參與構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)吞系統(tǒng)[20],作為一種主要定位在高爾基體上的外殼蛋白,參與囊泡的形成,是囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的重要組成部分[5-6]。小G蛋白中Arf GAP1,Arf GAP2和Arf GAP3對(duì)囊泡的形成具有重要作用[21-24],通過(guò)膜包裹、形成囊泡、與膜融合或斷裂的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,ArfGAPs能影響細(xì)胞間的物質(zhì)交流,以此調(diào)控植物生物進(jìn)程[25]。此外,高爾基體囊泡被認(rèn)為與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)物理相連[26],兩者構(gòu)成細(xì)胞重要的內(nèi)膜系統(tǒng),參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)超微結(jié)構(gòu)觀察,在低溫貯藏初期,高爾基體囊泡層數(shù)較少,僅可看到1~3層,而在低溫貯藏后期,高爾基體囊泡層數(shù)顯著增多,結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,可看到8~10層囊泡層數(shù),此時(shí)鱗莖已解除休眠狀態(tài),且LpAGD14基因的相對(duì)表達(dá)量增長(zhǎng)到最大值。分子生物分析結(jié)合組織形態(tài)觀察可以發(fā)現(xiàn),低溫貯藏期間,功能基因差異表達(dá)與囊泡層數(shù)變化存在內(nèi)在聯(lián)系,推測(cè)克隆得到的LpAGD14基因可能通過(guò)影響囊泡形成,從而影響物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,對(duì)百合鱗莖休眠與解除產(chǎn)生影響。

    4 結(jié)論

    在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)中,已確認(rèn)幾種具有ArfGAP活性的蛋白質(zhì),但大部分ArfGAP 基因在植物中的具體功能研究報(bào)道較少,尤其是對(duì)植物休眠的研究上僅在馬鈴薯中有過(guò)報(bào)道[11]。高爾基體小囊泡是物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要載體,對(duì)細(xì)葉百合LpAGD14基因的克隆與分析,及進(jìn)一步研究其對(duì)細(xì)胞體內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸作用機(jī)制和對(duì)休眠的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

    References:

    [1] Gillingham A K, Munro S. The small G proteins of the Arf family and their regulators. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 2007, 23(23): 579-611.

    [2] Tanabe K, Torii T, Natsume W,etal. A novel GTPase-activating protein for ARF6 directly interacts with clathrin and regulates clathrin-dependent endocytosis. Molecular Biology of the Cell, 2005, 16(4): 1617-1628.

    [3] Lanoix J, Ouwendijk J, Lin C,etal. GTP hydrolysis by arf-1 mediates sorting and concentration of Golgi resident enzymes into functional COP I vesicles. EMBO Journal, 1999, 18(18): 4935-4948.

    [4] Moss J, Vaughan M. Molecules in the ARF orbit. Journal of Biological Chemistry, 1998, 273(34): 21431-20434.

    [5] Pimpl P, Hanton S L, Taylor J P,etal. The GTPase ARF1p controls the sequence-specific vacuolar sorting route to the lyticvacuole.Plant Cell, 2003, 15: 1242-1256.

    [6] Moss J, Vaughan M. Structure and function of ARF proteins: activators of cholera toxin and critical components of intracellular vesicular transport processes. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(21): 12327-12330.

    [7] Poon P P, Cassel D, Huber I,etal. Expression, analysis, and properties of yeast ADP-ribosylation factor (ARF) GTPase activating proteins (GAPs) Gcs1 and Glo3. Methods Enzymol, 2001, 329: 317-324.

    [8] Yahara N, Sato K, Nakano A. The Arf1p GTPase-activating protein Glo3p executes its regulatory function through a conserved repeat motif at its C-terminus. Journal of Cell Science, 2006, 119(12): 2604-2612.

    [9] Zhuang X L, Jiang J F, Li J H,etal. Over-expression ofOsAGAP, an ARF-GAP, interferes with auxin influx, vesicle trafficking and root development. Plant Journal, 2006, 48(4): 581-591.

    [10] Liljegren S J, Leslie M E, Darnielle L,etal. Regulation of membrane trafficking and organ separation by the nevershed ARF-GAP protein. Development, 2009, 136(11): 1909-1918.

    [11] Liu B L, Zhang N, Wen Y K,etal. Identification of differentially expressed genes in potato associated with tuber dormancy release. Molecular Biology Reports, 2012, 39(12): 11277-11287.

    [12] Du Y P, Li S, He H B,etal. Comparative of methods for RNA extraction from Lily bulb scales. Molecular Plant Breeding, 2010, 8(4): 832-836.

    杜運(yùn)鵬, 李雙, 何恒斌, 等. 百合鱗片總RNA提取方法的比較. 分子植物育種, 2010, 8(4): 832-836.

    [13] Feng D L, Lai Y, He S L. Cloning, characterization and expression of anArfGAPgene from pepper (CapsicumannuumL.). Chinese Agricultural Science Bulletin, 2012, 28(34): 184-189.

    馮冬林, 賴燕, 何水林. 辣椒ArfGAP基因的克隆與表達(dá)分析. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 28(34): 184-189.

    [14] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

    [15] Liu K D, Li H L, Zhong S T,etal. Cloning, subcellular localization and expression analysis ofAsAGfrom sugar apple (AnnonaspuamosaL.). Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(1): 142-154.

    劉鍇棟, 黎海利, 鐘舒婷, 等. 番荔枝花器官發(fā)育基因AsAG的克隆, 亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(1): 142-154.

    [16] Liu F, Wang J Y, Wang X L,etal. The apical bud cell ultra-structure changes ofLiliumpumilumbulbs during breaking dormancy under refrigerated condition. Acta Horticulturae Sinica, 2013, 40(6): 1110-1118.

    劉芳, 王家艷, 王曉麗, 等. 細(xì)葉百合鱗莖在低溫解除休眠過(guò)程中莖尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化. 園藝學(xué)報(bào), 2013, 40(6): 1110-1118.

    [17] Zuk M, Prescha A, Keüpczynaski J,etal. ADP ribosylation factor regulates metabolism and antioxidant capacity of transgenic potato tuber. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 288-294.

    [18] Sun H M, Li T L, Li Y F. Starch metabolism and sprouting of bulb inLiliumdavidiivar.unicolorstored at different cold temperatures. Acta Horticulturae Sinica, 2004, 31(3): 337-342.

    孫紅梅, 李天來(lái), 李云飛. 不同貯藏溫度下蘭州百合種球淀粉代謝與萌發(fā)關(guān)系初探. 園藝學(xué)報(bào), 2004, 31(3): 337-342.

    [19] Liu F, Li D D, Lian H,etal. Relationship between dormancy breaking and protective enzymes in refrigeratedLiliumpumilumbulbs. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12): 180-187.

    劉芳, 李丹丹, 廉華, 等. 細(xì)葉百合冷藏過(guò)程中鱗莖保護(hù)酶活性與休眠解除的關(guān)系. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(12): 180-187.

    [20] Chen P W, Jian X, Luo R,etal. Simpleinvitroassay of Arf GAPs and preparation of Arf proteins as substrates. Methods in Cell Biology, 2015, 30: 69-80.

    [21] Kartberg F, Asp L, Dejgaard S Y,etal. ARFGAP2 and ARFGAP3 are essential for COPI coat assembly on the Golgi membrane of living cells. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(47): 36709-36720.

    [22] Oix J, Ouwendijk J, Stark A,etal. Sorting of Golgi resident proteins into different subpopulations of COPI vesicles: a role for ArfGAP1. Journal of Cell Biology, 2001, 155(7): 1199-1212.

    [23] Ismail S A, Vetter I R, Sot B,etal. The structure of an Arf-ArfGAP complex reveals a Ca2+regulatory mechanism. Cell, 2010, 141(5): 812-821.

    [24] Spang A, Shiba Y, Randazzo P A. ArfGAPs: gatekeepers of vesicle generation. FEBS Letters, 2010, 584(12): 2646-2651.

    [25] Dodonova S O, Diestelkoetter-Bachert P, von Appen A,etal. A structure of the COPI coat and the role of coat proteins in membrane vesicle assembly. Science, 2015, 349(6244): 195-198.

    [26] Sparkes I A, Ketelaar T, De Ruijter N C A,etal. Grab a Golgi: laser trapping of Golgi bodies revealsinvivointeractions with the endoplasmic reticulum. Traffic, 2009, 10(5): 567-571.

    猜你喜歡
    高爾基體細(xì)葉鱗莖
    高爾基體
    百合
    紫蕓英
    神經(jīng)鞘磷脂的研究進(jìn)展
    高爾基體與神經(jīng)退行性疾病研究進(jìn)展
    百合小鱗莖抽薹的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析
    2種百合科植物離體鱗莖誘導(dǎo)
    廣西細(xì)葉云南松森林資源動(dòng)態(tài)分析
    伊犁貝母鱗莖中非生物堿化學(xué)成分的研究
    中成藥(2014年9期)2014-02-28 22:28:55
    細(xì)葉小羽蘚孢子的超低溫保存
    日本黄色日本黄色录像| 老司机亚洲免费影院| 成人影院久久| 国产精品三级大全| 大码成人一级视频| 大香蕉久久成人网| 欧美精品一区二区免费开放| 麻豆av在线久日| 这个男人来自地球电影免费观看 | 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲精品视频女| 亚洲av日韩在线播放| 大陆偷拍与自拍| 久久久欧美国产精品| 日韩一区二区视频免费看| 两个人免费观看高清视频| 两个人免费观看高清视频| 国产不卡av网站在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 欧美黑人精品巨大| 日韩欧美一区视频在线观看| 成年动漫av网址| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| av视频免费观看在线观看| 久热这里只有精品99| 秋霞伦理黄片| 国产淫语在线视频| h视频一区二区三区| 午夜免费观看性视频| 99久久人妻综合| 男人舔女人的私密视频| www.自偷自拍.com| 丝袜喷水一区| avwww免费| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产免费现黄频在线看| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精品一二三| 熟女av电影| 久久av网站| 女性生殖器流出的白浆| 国产伦人伦偷精品视频| 老鸭窝网址在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 日本wwww免费看| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲精品国产一区二区精华液| xxx大片免费视频| xxx大片免费视频| 综合色丁香网| 国产视频首页在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 久久ye,这里只有精品| 校园人妻丝袜中文字幕| 看免费av毛片| 超碰成人久久| 在现免费观看毛片| 老司机在亚洲福利影院| 韩国av在线不卡| 老司机靠b影院| 精品亚洲成国产av| 日本91视频免费播放| 热99久久久久精品小说推荐| 国产成人精品福利久久| 在线看a的网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 国产一区二区在线观看av| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品免费大片| 久久久精品94久久精品| xxxhd国产人妻xxx| 一本久久精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产日韩欧美视频二区| 韩国高清视频一区二区三区| 成年av动漫网址| 男女无遮挡免费网站观看| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美激情高清一区二区三区 | 久久精品久久精品一区二区三区| 嫩草影院入口| 久久精品久久精品一区二区三区| 99久久综合免费| 一二三四在线观看免费中文在| 另类精品久久| 男女午夜视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美人与善性xxx| 伦理电影大哥的女人| 免费高清在线观看日韩| 久久99一区二区三区| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一区二区av电影网| 高清av免费在线| 青青草视频在线视频观看| 午夜福利视频精品| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产黄频视频在线观看| 只有这里有精品99| 中文字幕色久视频| 日本av手机在线免费观看| 人妻人人澡人人爽人人| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产在线一区二区三区精| 国产伦理片在线播放av一区| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久精品国产亚洲av高清一级| 99香蕉大伊视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲四区av| 婷婷色av中文字幕| 国产又爽黄色视频| 九草在线视频观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 五月天丁香电影| 婷婷成人精品国产| 亚洲图色成人| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 美女高潮到喷水免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 看免费成人av毛片| 免费观看av网站的网址| 亚洲精品视频女| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 午夜福利乱码中文字幕| 啦啦啦 在线观看视频| 精品福利永久在线观看| 操出白浆在线播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美 日韩 精品 国产| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久久久久久久久免费av| 一级,二级,三级黄色视频| 女人精品久久久久毛片| 两个人看的免费小视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 免费观看性生交大片5| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲三区欧美一区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 毛片一级片免费看久久久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美人与善性xxx| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久精品久久久久真实原创| 多毛熟女@视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产日韩欧美在线精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 观看av在线不卡| 国产亚洲欧美精品永久| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产色婷婷99| 天天添夜夜摸| 久久性视频一级片| 欧美中文综合在线视频| 日韩欧美精品免费久久| 老汉色∧v一级毛片| 1024香蕉在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 少妇被粗大猛烈的视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品久久久精品久久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产日韩欧美亚洲二区| 捣出白浆h1v1| 一级片免费观看大全| 久久这里只有精品19| 久久久久人妻精品一区果冻| 精品久久久精品久久久| 999久久久国产精品视频| 一区福利在线观看| 看十八女毛片水多多多| 麻豆av在线久日| 亚洲伊人久久精品综合| 一级毛片电影观看| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲图色成人| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 免费观看人在逋| 国产一区二区在线观看av| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 观看av在线不卡| 一级毛片 在线播放| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日日摸夜夜添夜夜爱| 免费看av在线观看网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品久久久av美女十八| h视频一区二区三区| 伦理电影大哥的女人| 婷婷色综合大香蕉| 久久热在线av| 日韩免费高清中文字幕av| 国产深夜福利视频在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 又大又爽又粗| 国产亚洲欧美精品永久| av不卡在线播放| 99久久人妻综合| 亚洲中文av在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 精品视频人人做人人爽| 老司机影院毛片| 国产福利在线免费观看视频| 国产av精品麻豆| 香蕉国产在线看| 免费av中文字幕在线| 老司机影院成人| av在线老鸭窝| 国产男女超爽视频在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 在线观看三级黄色| 一本久久精品| 新久久久久国产一级毛片| 高清视频免费观看一区二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 在线观看免费午夜福利视频| 国产亚洲最大av| 下体分泌物呈黄色| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费观看av网站的网址| 国产97色在线日韩免费| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久久久久人妻| 十八禁网站网址无遮挡| 免费高清在线观看视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 久久久久精品性色| 一区二区日韩欧美中文字幕| 午夜福利网站1000一区二区三区| 中文字幕色久视频| 99九九在线精品视频| 国产在线一区二区三区精| 捣出白浆h1v1| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 免费观看性生交大片5| www.自偷自拍.com| www.av在线官网国产| 亚洲天堂av无毛| av天堂久久9| 激情视频va一区二区三区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 最黄视频免费看| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 精品国产一区二区三区四区第35| 人成视频在线观看免费观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久久久久大尺度免费视频| 91成人精品电影| 国产精品国产av在线观看| 国产在线免费精品| 男女之事视频高清在线观看 | 老司机亚洲免费影院| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 超碰成人久久| 超碰成人久久| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品久久久久久精品电影小说| 青春草国产在线视频| 乱人伦中国视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产一区二区激情短视频 | 哪个播放器可以免费观看大片| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看| av有码第一页| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 色播在线永久视频| 亚洲少妇的诱惑av| 天天操日日干夜夜撸| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费高清在线观看日韩| xxx大片免费视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 91成人精品电影| 男女之事视频高清在线观看 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黑人猛操日本美女一级片| 国产片特级美女逼逼视频| 国产一卡二卡三卡精品 | 久久久久久久精品精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 成人国产麻豆网| 热99国产精品久久久久久7| 捣出白浆h1v1| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 大话2 男鬼变身卡| 久久97久久精品| 国产精品国产av在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 无限看片的www在线观看| 人妻一区二区av| 亚洲熟女精品中文字幕| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产成人系列免费观看| 国产成人精品久久二区二区91 | 免费观看性生交大片5| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 51午夜福利影视在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 老司机影院成人| 国产伦理片在线播放av一区| 欧美日韩一级在线毛片| netflix在线观看网站| 欧美av亚洲av综合av国产av | 丝袜美足系列| avwww免费| 婷婷色麻豆天堂久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 午夜福利乱码中文字幕| 日本av免费视频播放| 十八禁高潮呻吟视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲三区欧美一区| 老司机影院毛片| 国产男女内射视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产免费现黄频在线看| 日韩大片免费观看网站| 亚洲五月色婷婷综合| 黄色视频不卡| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 妹子高潮喷水视频| 欧美激情高清一区二区三区 | 美女午夜性视频免费| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 哪个播放器可以免费观看大片| 我要看黄色一级片免费的| 欧美黄色片欧美黄色片| 99热网站在线观看| 欧美日韩精品网址| 岛国毛片在线播放| 一级片'在线观看视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 男女免费视频国产| 黄片播放在线免费| av线在线观看网站| 男女边摸边吃奶| www.熟女人妻精品国产| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲在久久综合| 精品午夜福利在线看| 免费看av在线观看网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 免费观看性生交大片5| 一个人免费看片子| 麻豆av在线久日| av卡一久久| 秋霞伦理黄片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| a级毛片黄视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 色综合欧美亚洲国产小说| 飞空精品影院首页| 国产免费福利视频在线观看| 久久久久久久久免费视频了| av在线老鸭窝| 在线观看免费日韩欧美大片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲男人天堂网一区| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产av一区二区精品久久| 日韩伦理黄色片| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲中文av在线| 国产激情久久老熟女| 亚洲国产精品国产精品| 国产极品天堂在线| 9191精品国产免费久久| 在线精品无人区一区二区三| 国产精品免费大片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产av码专区亚洲av| 天美传媒精品一区二区| 秋霞伦理黄片| 色婷婷av一区二区三区视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 中文字幕人妻丝袜制服| 观看美女的网站| 精品视频人人做人人爽| 免费在线观看黄色视频的| 老司机影院成人| 国产探花极品一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 老司机靠b影院| 日韩av在线免费看完整版不卡| 超碰成人久久| 看免费成人av毛片| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲国产精品国产精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人av激情在线播放| 波多野结衣av一区二区av| 视频区图区小说| 超碰97精品在线观看| 美女大奶头黄色视频| 日韩欧美精品免费久久| 捣出白浆h1v1| www.熟女人妻精品国产| 国产又爽黄色视频| 少妇人妻 视频| 亚洲成人一二三区av| 一级,二级,三级黄色视频| 高清欧美精品videossex| 欧美激情极品国产一区二区三区| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲天堂av无毛| 亚洲四区av| 午夜福利免费观看在线| 亚洲情色 制服丝袜| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 男人舔女人的私密视频| 欧美精品一区二区免费开放| 一级黄片播放器| 亚洲激情五月婷婷啪啪| www日本在线高清视频| 女人久久www免费人成看片| 国产精品欧美亚洲77777| 精品一区二区三卡| 操美女的视频在线观看| 久久久久久人妻| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩一区二区三区影片| 日韩人妻精品一区2区三区| 不卡av一区二区三区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美黑人精品巨大| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 在线观看人妻少妇| av片东京热男人的天堂| 婷婷成人精品国产| 亚洲av国产av综合av卡| 午夜激情av网站| 永久免费av网站大全| 老司机深夜福利视频在线观看 | 老司机影院成人| 在线天堂最新版资源| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品偷伦视频观看了| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 悠悠久久av| 青草久久国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美人与性动交α欧美软件| 天天添夜夜摸| 色播在线永久视频| 久久久久久久久久久免费av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 男女床上黄色一级片免费看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品欧美亚洲77777| 日本欧美视频一区| 狂野欧美激情性xxxx| 91成人精品电影| 各种免费的搞黄视频| videos熟女内射| 精品一区二区免费观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品成人在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产黄色免费在线视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 大话2 男鬼变身卡| 亚洲四区av| av.在线天堂| 中文字幕精品免费在线观看视频| 99国产综合亚洲精品| 丝袜美足系列| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲色图综合在线观看| 午夜福利一区二区在线看| xxx大片免费视频| 国产精品久久久av美女十八| 中文字幕色久视频| 欧美97在线视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 成年动漫av网址| 亚洲国产av新网站| 欧美国产精品va在线观看不卡| 中文字幕人妻丝袜制服| 日本欧美国产在线视频| 久久99一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 天堂中文最新版在线下载| 曰老女人黄片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 免费黄色在线免费观看| av在线观看视频网站免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜av观看不卡| 久久久久久久国产电影| 在线观看免费午夜福利视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产爽快片一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲欧洲国产日韩| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 两性夫妻黄色片| 晚上一个人看的免费电影| 视频区图区小说| www.自偷自拍.com| 桃花免费在线播放| 男女无遮挡免费网站观看| 国产亚洲最大av| 欧美人与善性xxx| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 精品酒店卫生间| 色播在线永久视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产 精品1| 成人手机av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 亚洲第一av免费看| 国产精品免费大片| 国产毛片在线视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 99国产综合亚洲精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产免费福利视频在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 18在线观看网站| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲国产av新网站| 国产xxxxx性猛交| 激情五月婷婷亚洲| 91精品三级在线观看| 嫩草影院入口| 精品国产乱码久久久久久男人| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 激情视频va一区二区三区| 日本一区二区免费在线视频| 伊人久久国产一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 两个人看的免费小视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久精品国产综合久久久| 久久99一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品,欧美精品| 嫩草影视91久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 黄片小视频在线播放| 午夜日韩欧美国产| 国产成人精品久久久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 99精品久久久久人妻精品| av线在线观看网站| 在线观看三级黄色|