鴨瘟活疫苗滴鼻誘導的黏膜免疫效果評價

李愛欣，李穎異，蔣文燦，胡 欣，李 鑫，曾曉慧，白 瑜

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 溫江611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都611130)

鴨瘟(Duck plague，DP)，又稱鴨病毒性腸炎，是由鴨瘟病毒(DPV)引起的鴨、鵝和其它雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性疾病[1]。DPV能夠在鴨或其它水禽體內(nèi)持續(xù)存在，并且定期向體外排毒而在鴨群中廣泛傳播，引起DP的流行，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了較大經(jīng)濟損失[2]。目前國內(nèi)外沒有確實有效的治療方式，主要通過肌肉、皮下注射DPV疫苗等方法來預防DP的發(fā)生和流行[3]。

黏膜免疫系統(tǒng)是機體整個免疫系統(tǒng)的重要組成部分。研究表明，使用合適劑量活疫苗經(jīng)黏膜免疫能夠有效預防雞傳染性支氣管炎、雞新城疫等家禽傳染病[4-5]，且常見活疫苗黏膜接種途徑中，滴鼻免疫綜合效果較好[6-8]。但目前這些方法未見在DP預防中廣泛應用。

IgA、IgM、IgG是機體抗感染過程中產(chǎn)生的3種主要抗體，其中IgA是黏膜免疫的主要效應分子，IgM是抗感染過程中最早出現(xiàn)的抗體，IgG是最主要的抗體[9-10]。綜合檢測這3種抗體水平可以全面、直觀地評價免疫效果?；诖耍狙芯繖z測了DPV活疫苗滴鼻免疫與肌注免疫鴨的呼吸道、消化道不同組織器官黏膜IgA、IgG、IgM的含量，并結合攻毒試驗來評價不同免疫方式誘導的黏膜免疫效果，為臨床DP選擇滴鼻免疫在鴨病防治上的實際應用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 鴨必應-鴨瘟活疫苗，500羽份/瓶，購自哈藥集團生物疫苗有限公司；DPV Chv強毒株由四川農(nóng)業(yè)大學禽病防治研究中心分離鑒定；鴨IgA ELISA檢測試劑盒(批號：20161206)、鴨IgG ELISA檢測試劑盒(批號：20161206)、鴨IgM ELISA檢測試劑盒(批號：20161206)，均購自深圳子科生物科技有限公司。1日齡奧白星肉鴨，購自成都克里莫育種有限公司。

1.2 雛鴨免疫試驗84羽1日齡雛鴨，正常飼養(yǎng)至21日齡，隨機分組后進行下述免疫試驗(表1)。

表1 雛鴨免疫的實驗設計Table 1 Design for antibody detection experiment

1.3 免疫鴨的抗體檢測 于首免后第7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d分別隨機選取對照組、一免滴鼻組、一免肌注組各3羽，采集其鼻腔拭子、氣管、腺胃、十二指腸、直腸各2塊組織樣品。將組織樣品分別放入裝有1 mL PBS的EP管中剪碎，4℃放置24 h后1 000 r/min離心10 min、8 000 r/min離心6 min后取上清液，按ELISA試劑盒說明操作，檢測鴨鼻腔及各組織器官中特異性抗體含量。二免滴鼻組、二免肌注組分別于首免后第14 d、21 d、28 d、35 d、42 d各隨機選取3羽采樣，采樣及抗體檢測方法同一免組。實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進行初步處理及整理，建立試劑盒標準品濃度與OD450nm值的方程并繪制標準曲線(R2為0.9678～0.983)，將測得的OD450nm值換算為抗體滴度，并使用GraphPad Prism 7.0軟件統(tǒng)計繪制各組鴨消化道、呼吸道各組織器官IgA、IgG、IgM抗體滴度隨時間變化的直方圖。

1.4 攻毒試驗設計 將30羽1日齡雛鴨按如下分組：一免滴鼻組、肌注組，各6羽，于21日齡時滴鼻/肌注接種1羽份鴨瘟活疫苗；二免滴鼻組、肌注組，各6羽，于21日齡、28日齡各滴鼻或肌注接種1羽份鴨瘟活疫苗；對照組6羽，不接種疫苗。56日齡(即免疫后35 d)時所有鴨均肌注100 LD50鴨瘟Chv株強毒液，觀察18 d，每天記錄鴨發(fā)病死亡情況。

2 結果

2.1 各組鴨抗體檢測結果 將84羽21日齡雛鴨隨機分5組，分別為一免滴鼻組(NAⅠ)與一免肌注組(IMⅠ)(僅免疫一次鴨瘟活疫苗)、二免滴鼻組(NAⅡ)與二免肌注組(NAⅡ)(首免后7 d加強免疫一次鴨瘟活疫苗)、對照組。首免后，每隔7 d隨機選取各組各3羽鴨，采用ELISA法檢測其呼吸道與消化道各組織器官黏膜中DPV特異性IgA抗體水平。結果顯示，除對照組外，各組雛鴨免疫后7 d均可檢出IgA，免疫后42 d該抗體水平仍顯著高于對照組(p＜0.01)。除十二指腸外，滴鼻組鴨該抗體均于免疫后21 d達到最高水平，較肌注組早7 d達到峰值。滴鼻組鴨鼻、氣管、十二指腸中該抗體峰值均略高于肌注組(p＞0.05)，二免滴鼻組鴨胃、直腸中該抗體峰值均高于肌注組(p＜0.05)(圖1)。表明，滴鼻接種能夠較早誘導機體產(chǎn)生黏膜免疫，并且達到相對高的IgA抗體水平。

圖1 各組鴨不同組織器官特異性Ig A抗體檢測結果Fig.1 The dynamics of DPV specific IgA titers in the ducklings from different groups

除對照組外，各組鴨各組織器官于免疫后7 d即可檢出IgG，且于免疫后14 d達到峰值，免疫后42 d仍能檢出該抗體。滴鼻組氣管、胃、十二指腸3個器官均較肌注組IgG抗體水平高(p＜0.05)。二免肌注組鴨鼻、胃、直腸中該抗體峰值高于滴鼻組(p＜0.05)，其余2個組織器官(十二指腸、氣管)該抗體水平兩組基本持平(p＞0.05)。結果表明滴鼻與肌注刺激黏膜產(chǎn)生的IgG抗體水平相差不大，這與IgG為血源性抗體，在黏膜中含量不高有關。

各組鴨各組織器官于免疫后7 d即可檢出IgM抗體且達到峰值，隨后迅速降低。除十二指腸一免后兩組該抗體水平持平外(p＞0.05)，其它組織器官該抗體水平滴鼻組均顯著低于肌注組(p＜0.01)。二免滴鼻組鴨的胃、直腸該抗體峰值顯著高于肌注組(p＜0.01)，僅氣管該抗體水平顯著低于肌注組(p＜0.01)。表明一免后滴鼻和肌注對IgM抗體水平影響不大，但二免滴鼻組粘膜免疫效果略優(yōu)于肌注組。

綜合圖1、2、3，滴鼻組與肌注組經(jīng)活疫苗免疫后鴨黏膜中各種DPV特異性抗體水平較對照組均有明顯升高(p＜0.01)。這3種抗體在機體相同器官的產(chǎn)生發(fā)展規(guī)律與齊雪峰的研究結果基本一致[11]：兩種免疫途徑免疫鴨各器官黏膜抗體水平中IgM峰值出現(xiàn)時間最早，且滴度下降較快；IgA抗體水平于各器官黏膜中最高，且存留時間較長，免疫后42 d仍然能檢測到高滴度IgA；通過對兩種途徑免疫鴨黏膜中各抗體滴度的比較顯示：滴鼻免疫DPV活疫苗鴨黏膜中的IgA抗體滴度高于肌注免疫，但兩種免疫方式對IgG和IgM抗體水平影響不顯著。

圖2 各組鴨不同組織器官特異性IgG抗體檢測結果Fig.2 The dynamics of DPV specific IgG titers in the ducklings from different groups

圖3 各組鴨不同組織器官特異性IgM抗體檢測結果Fig.3 The dynamics of DPV specific IgM titers in the ducklings from different groups

表2 免疫鴨的攻毒保護試驗結果Table 2 Protection of immunized ducklings against DPV challenging

2.2 免疫鴨的攻毒試驗結果 采用相同的方式免疫鴨后以100倍LD50劑量的鴨瘟Chv株強毒攻擊。結果顯示，經(jīng)過一次加強免疫后，滴鼻組鴨的攻毒保護率從83.33 %上升至100 %；肌注組保護率均為100 %。這表明低免疫劑量滴鼻有一定的免疫不確實的風險。本實驗中肌注組達到100 %保護率，但也不能忽略實際生產(chǎn)中肌注應激性較大的缺點。

3 討論

臨床證實，使用DPV活疫苗預防鴨瘟能起到較好的效果，但以往對免疫效果的評價常局限于血清中特異性IgG這一個指標。95 %以上病原體的入侵發(fā)生在人或動物的黏膜組織，黏膜組織中的黏膜免疫系統(tǒng)(Mucosal immune system，MIS)是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機體抗感染的第一道免疫屏障，對預防通過黏膜入侵機體的病原體引起的疾病具有重要意義，黏膜中特異性IgA水平是反映黏膜免疫效果的重要指標[12-14]。本實驗結果顯示鴨消化道及呼吸道黏膜中抗DPV特異性IgA、IgM、IgG的產(chǎn)生和變化規(guī)律各有其特點，并且與其在血清中產(chǎn)生的規(guī)律有一定的相似之處[15]，免疫后Ig M檢出時間最早下降最快且含量最少，IgA、IgG含量較高且能維持一定時間。IgM在緊急預防和早期免疫中發(fā)揮重要作用，在采樣的各器官均最先產(chǎn)生，為IgA和IgG進一步中和病原奠定基礎[5,11]。而IgA于免疫兩周后達到峰值且能維持較長時間，該類抗體作為黏膜免疫的主要效應分子，是黏膜中檢出滴度最高的一類抗體，在血清中含量不高，符合其主要由黏膜淋巴細胞分泌的特性[14]。IgG與IgA相反，IgG為血源性抗體，在血清中含量更高，在黏膜中的含量要低一些，且有研究顯示動物機體消化道黏膜固有層中可分泌IgG的B細胞數(shù)量較少，黏膜分泌液中的IgG主要來源于血清[5,11]。3種特異性抗體的產(chǎn)生與消失均遵循一個較為固定的規(guī)律，不易受免疫方式的影響。

本實驗結果顯示，DPV活疫苗經(jīng)滴鼻和肌注兩種不同途徑免疫鴨，均可以誘導鴨呼吸道和消化道局部黏膜產(chǎn)生DPV特異性抗體，具有一定的保護力。肌注雖然不能像滴鼻那樣直接激活黏膜免疫，但DPV活疫苗肌注免疫鴨糞便中的病毒進入環(huán)境，可以重新進入雛鴨體內(nèi)，接觸黏膜誘導免疫[16]。而通過滴鼻接種DPV活疫苗，可以使DPV弱毒同時接觸鴨鼻、喉等呼吸道器官及其咽、食道等消化道，且在呼吸道黏膜致敏的淋巴細胞也可以傳播到消化道等其它器官的黏膜組織，使消化道黏膜也能檢測出較高滴度的IgA[17]。綜合各項數(shù)據(jù)可知，使用DPV活疫苗通過滴鼻免疫可以激發(fā)較好的免疫效力，但也有其缺點。

由于目前尚無市售DPV專用滴鼻疫苗，本實驗采用了市售常用的商品疫苗，這對滴鼻的實驗結果可能產(chǎn)生一定影響。一次免疫時滴鼻組鴨IgM抗體在各器官的峰值均普遍低于肌注組鴨，表明低劑量的該DPV商品疫苗滴鼻誘導產(chǎn)生IgM的速度較肌注慢、水平低，早期保護力較弱，二次免疫后可以加強早期保護力，誘導較高且持續(xù)時間較長的抗體水平。

本實驗結果顯示滴鼻組的DPV特異性IgA抗體水平較肌注組提早7 d達到峰值，二次免疫后的5個采樣器官中，有4個器官(鼻、氣管、腺胃、直腸)抗體峰值均超過肌注組，僅1個器官該抗體峰值與肌注組持平。這表明滴鼻使DPV弱毒直接接觸黏膜，相較肌注更快、更多地誘導了黏膜免疫的主要效應分子IgA的產(chǎn)生。滴鼻的優(yōu)點在于激發(fā)免疫應答快，提高免疫劑量后產(chǎn)生的免疫效果較肌注更好[18]，且較肌注產(chǎn)生的應激性小，能夠避免肌注所致防衛(wèi)機能減弱、易引發(fā)感染引發(fā)疾病等情況發(fā)生[19]。在臨床中進行滴鼻免疫時，會出現(xiàn)液體滑脫現(xiàn)象，參考雞用滴鼻瓶進一步改進盛裝疫苗液的容器，可能會彌補這一不足[18]，或者摸索合適的免疫劑量，進行二次免疫，均能夠優(yōu)化滴鼻免疫效果。

本研究結果表明，DPV活疫苗滴鼻免疫可以誘導鴨產(chǎn)生與肌注接近同等的保護力，并且其應激性相對較小，使用專用容器或二次免疫均能夠優(yōu)化滴鼻免疫的效果。為滴鼻免疫在鴨病防治上的實際應用提供參考和依據(jù)。