表達鵝γ干擾素重組禽痘病毒的構(gòu)建及其抗病毒活性的初步研究

張紫璇，韓明子，高 旭，李遠超，孟 媛，李卓昕，王美淇，劉晉宇

(1.延邊大學農(nóng)學院 動物醫(yī)學系，吉林 延吉133000；2.延邊州動物疫病預防控制中心，吉林 延吉133000)

干擾素(Interferon，IFN)是宿主細胞在病毒或特定的誘生劑作用下產(chǎn)生的一類分泌型多功能糖蛋白，有廣譜抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能的作用[1]，是重要的細胞因子之一。1995年，Lowenthal等從雞脾淋巴細胞中得到與哺乳動物γ干擾素(IFN-γ)功能相似的IFN[2]。Digby等用RT-PCR方法從被誘導的T細胞中獲 得 了IFN-γ基 因[3]。1999年，Lambrecht等分別表達了IFN-Ⅰ和IFN-Ⅱ并進行活性研究，表明E.coli和COS細胞表達的IFN與天然IFN同樣具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，且II型IFN-γ干擾素的免疫調(diào)節(jié)能力強于IFN-I[4]。

改造過的禽痘病毒(Fowlpox virus，F(xiàn)PV)表達外源蛋白的非必需區(qū)序列較長，并且FPV基因組序列十分龐大，又能夠通過磷酸化，糖基化等修飾外源蛋白，有利于外源蛋白的表達[5]。本研究為了更好的發(fā)揮FPV作為疫苗活載體的優(yōu)勢，將鵝IFN-γ基因(GoIFN-γ)重組至FPV，研究GoIFN-γ能否在FPV中穩(wěn)定表達，以及能否抑制鵝細小病毒(GPV)的活性，為共表達GPV VP3基因和IFN-γ基因的重組痘病毒疫苗研究和免疫學評價奠定基礎(chǔ)，同時對進

一步闡明IFN-γ在免疫系統(tǒng)中的作用原理和特點具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 種毒與載體pSY538、pSC11、pSY681質(zhì)粒和S-FPV-017株FPV(2.13×106pfu/mL)由哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；pMD18T-IFN-γ由延邊大學預防獸醫(yī)學實驗室構(gòu)建和保存[6]；GPV YBYJ株(GPV)由延邊大學預防獸醫(yī)學實驗室保存[7]。

1.2 雞胚與主要試劑9日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司；ExTaq酶，X-gal和限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；小鼠抗鵝IFN-γ蛋白多克隆抗體由本實驗室制備；山羊抗小鼠IgG-FITC購自Affinity Biosciences；DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；Endo-free Plasmid Mini KitⅠ購自O(shè)mega公司；X-tremeGENETMHP DNA Transfection Reagent購 自SIGMA-ALDRICH公司；VirusGen Purification Kit購自康為世紀公司。

1.3 含GoIFN-γ基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 根據(jù)Gen-Bank中登錄的GoIFN-γ基因(JX966250)的核苷酸序列[8]，使用Oligo 6.0軟件設(shè)計合成1對引物(P1：5'-GAATTCATGACTTGCCAGACCTACTGCTT-3'/P2：5'-GAATTCTTATTAACATCTGCATCTCTTTGG-3')，在引物的兩端加入EcoRⅠ酶切位點，以pMD18TIFNγ為模板進行GoIFN-γ基因全序列擴增，擴增片段的長度為495 bp。將擴增的目的片段回收純化后克隆至載體pSY538中早晚期啟動子LP2EP2下游的EcoRⅠ位點，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pSY538-IFNγ；通過SmaⅠ位點將質(zhì)粒pSC11中在晚期啟動子P11控制下的LacZ基因報告盒插入pSY538-IFNγ質(zhì)粒中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pSY538-IFNγ-LacZ；再用NotⅠ酶切pSY538-IFNγ-LacZ質(zhì)粒，獲得LP2EP2控制下的IFN-γ-LacZ基因，將其克隆至含有FPV復制非必需區(qū)的pSY681載體的NotⅠ位點，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pSY681-IFNγ-LacZ。參照OMEGA Endo-free Plasmid Mini KitⅠ使用說明純化質(zhì)粒pSY681-IFNγ-LacZ并利用NotⅠ酶切鑒定該質(zhì)粒。

1.4 重組FPV的篩選與純化 待六孔板中雞胚成纖維細胞(CEF)匯合度達80 %時30μL/孔加入FPV S-FPV-017，37℃孵育2 h，按照X-tremeGENETMHP DNA Transfection Reagent使用說明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSY681-IFNγ-LacZ，6 h后換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲病毒，反復凍融后1 200 r/min離心，收獲上清病毒，用無血清的DMEM培養(yǎng)液作10倍倍比稀釋后分別接種于單層CEF，37℃感作2 h，棄液，加入含有1.5 %低熔點瓊脂糖的DMEM固體培養(yǎng)基，細胞出現(xiàn)典型CPE后加入X-gal至終濃度為300μg/mL的DMEM營養(yǎng)瓊脂進行染色，繼續(xù)培養(yǎng)12 h～16 h，挑取藍色蝕斑溶于1 mL無血清DMEM培養(yǎng)液中。凍融3次后進行下一輪純化，直至篩選到穩(wěn)定的重組FPV。

1.5 重組FPV的PCR鑒定 收獲含重組病毒rFPV-IFNγ-LacZ的細胞反復凍融后，1 200 r/min離心后收取上清病毒，37℃5 % CO2條件下利用含3 %血清的DMEM擴大培養(yǎng)后，按照VirusGen Purification Kit使用說明提取rFPV-IFNγ-LacZ的核酸為模板，采用P1/P2引物進行PCR鑒定。

1.6 重組FPV的間接免疫熒光(IFA)檢測 分別將重組病毒rFPV-IFNγ-LacZ和親本病毒S-FPV-017接種六孔板內(nèi)單層CEF，培養(yǎng)72 h至細胞出現(xiàn)明顯CPE后用PBS清洗并用冷丙酮固定10 min后棄液，自然晾干后以鼠抗鵝IFN-γ蛋白多克隆抗體(1∶100)為一抗，山羊抗小鼠IgG-FITC(1:800)為二抗，分別進行IFA檢測。

1.7 抗病毒活性檢測 將rFPV-IFNγ-LacZ接種于單層CEF，在37℃5 % CO2條件下培養(yǎng)96 h，收獲上清，利用0.22μm的微孔濾膜過濾接種于12孔板內(nèi)單層CEF(2×106cell/孔)，培養(yǎng)12 h后棄液，加入100TCID50的GPV孵育2 h后棄液，加入維持液培養(yǎng)至待陽性對照出現(xiàn)明顯CPE時，采用細胞病變抑制法檢測重組FPV表達的GoIFN-γ蛋白的抗病毒活。同時設(shè)立GPV陽性對照組和空白對照組，每組重復4孔。

2 結(jié)果

2.1 pSY681-IFNγ-LacZ轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建 重組質(zhì)粒pSY681-IFNγ-LacZ轉(zhuǎn)移載體含有早晚期啟動子LP2EP2控制的IFN-γ基因，晚期啟動子P11控制的LacZ基因和親本禽痘病毒同源序列(圖1)。重組質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示獲得兩條特異性條帶，與預期相符(5 878 bp和3 700 bp)(圖2)。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序，結(jié)果顯示序列正確，表明正確構(gòu)建pSY681-IFNγ-LacZ轉(zhuǎn)移載體。

圖1 轉(zhuǎn)移載體pSY681-IFNγ-LacZ的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Map of transfer plasimid pSY681-IFNγ-LacZ

圖2 重組質(zhì)粒pSY681-IFNγ-LacZ的酶切鑒定Fig.2 Identification of pSY681-IFNγ-LacZ by NotⅠdigestion

2.2 重組禽痘病毒的篩選及PCR鑒定 將重組質(zhì)粒pSY681-IFNγ-LacZ轉(zhuǎn)染親本病毒S-FPV-017經(jīng)同源重組篩選到重組病毒rFPV-IFNγ-LacZ，因其含有LacZ報告基因，經(jīng)9輪篩選后可見在含有X-gal的固體培養(yǎng)基中全部為藍色蝕斑(圖3)，表明獲得了能夠穩(wěn)定表達LacZ的重組病毒。提取重組病毒DNA為模板，PCR鑒定結(jié)果顯示擴增獲得了500 bp的GoIFN-γ基因片段(圖4)，表明篩選獲得了含GoIFN-γ的重組FPV。

圖3 重組禽痘病毒的篩選Fig.3 The selection of recombinant FPV

圖4 重組FPV的PCR鑒定Fig.4 Identification of GoIFN-γgene in rFPV-IFNγ-LacZ by PCR

2.3 重組FPV表達IFN-γ蛋白的IFA檢測 分別將重組病毒rFPV-IFNγ-LacZ和親本病毒S-FPV-017接種六孔板內(nèi)單層CEF，利用IFA進行檢測，結(jié)果顯示，rFPV-IFNγ-LacZ感染的CEF在胞內(nèi)和胞漿中均出現(xiàn)特異性熒光反應，親本病毒S-FPV-017感染的CEF未出現(xiàn)熒光反應(圖5)。表明rFPV-IFNγ-LacZ表達了IFN-γ蛋白。

2.4 重組FPV抗病毒的活性檢測 將rFPV-IFNγ-LacZ和鵝細小病毒于CEF中共培養(yǎng)，待GPV陽性對照組細胞出現(xiàn)明顯CPE后時，而rFPV-IFNγ-LacZ試驗組細胞貼壁情況良好，有少量懸浮細胞，未出現(xiàn)明顯CPE(圖6A)；空白對照組細胞正常生長(圖6B)。表明重組病毒rFPV-IFNγ-LacZ表達的IFN-γ在體外具有良好的抗病毒活性，能夠抵抗GPV對細胞的感染。

圖5 rFPV-IFNγ-LacZ感染CEF的IFA鑒定結(jié)果Fig.5 Identification of the rFPV-IFNγ-LacZ by IFA

圖6 重組FPV表達的GoIFN-γ在CEF中抗GPV活性的檢測Fig.6 Antiviral activity of GoIFN-γexpressed from rFPV-IFNγ-LacZ against GPV in CEF

3 討論

IFN-γ具有嚴格的選擇性，靶向作用于非正常細胞，能夠使機體迅速產(chǎn)生反應并長時間處于抗病毒狀態(tài)，但是只有在特定的病原刺激下被抑制的IFN-γ才能表達，與此同時動物體內(nèi)分泌的IFN-γ數(shù)量有限，在很大程度上制約了IFN的廣泛應用。因此，建立一個高效而又穩(wěn)定的表達系統(tǒng)至關(guān)重要。IFN原核表達真核基因時在一定程度上真核基因的信號肽會影響基因表達產(chǎn)物的活性[9]。所以本研究利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)對IFN-γ基因進行了體外真核表達，獲得了能夠穩(wěn)定表達IFN-γ基因的重組病毒。

隨著活載體疫苗的不斷開發(fā)，痘病毒(包括FPV)作為較成熟的多效病毒載體已表達數(shù)10種不同的保護性抗原[10]，在美國，表達新城疫病毒Hitchner B株HN基因和F基因，Texas株HN基因和F基因的重組FPV疫苗已經(jīng)被使用[11]，實踐證明重組禽痘疫苗可以使免疫雞對強毒產(chǎn)生良好的免疫效果。但是與常規(guī)疫苗相比其免疫的雛雞存在體重減輕和免疫抑制[12]，為了減少FPV殘留的毒性，嘗試在疫苗中引入細胞因子作為佐劑[13]。Schijns等將重組桿狀病毒表達的貓IFN-γ作為滅活狂犬病疫苗的免疫佐劑免疫3月齡貓，與單獨使用滅活狂犬疫苗相比其血清中抗體滴度顯著提高[14]。Rautenschlein等融合表達火雞紐卡斯爾病病毒和IFN-II的疫苗接種SPF火雞胚，與單獨接種紐卡斯爾病毒疫苗的火雞胚相比，孵化率和存活率無變化的情況下同時出現(xiàn)輕微的增重效應，前者提前一周產(chǎn)生抗紐卡斯爾病毒抗體并具有良好的免疫保護能力[15]。IFN-γ作為免疫佐劑具有增重效應和免疫調(diào)節(jié)功能，能夠增強機體的抗感染能力，并減少免疫原性蛋白基因重組疫苗的毒副作用。本實驗用FPV表達載體表達IFN-γ基因可用于體外人工制備IFN，也為研制GoIFN-γ疫苗佐劑和共表達保護性抗原和IFN-γ的重組基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

細胞病變抑制法測定重組GoIFN-γ的抗病毒活性，結(jié)果顯示重組FPV表達的IFN-γ蛋白能夠有效抑制GPV介導的CEF表面抗原的表達。Mallick等[16]在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達的雞IFN-γ和劉新文等[17]應用酵母分泌表達的雞IFN-γ均對水泡口炎病毒在CEF中的增殖具有抑制效果。這與本實驗的結(jié)果是一致的，表明真核系統(tǒng)表達IFN-γ在體外具有抗病毒活性，但IFN-γ的其它活性功能還需要進一步探究。

IFN的活性具有相對的種屬特異性，所以其不僅對同種屬或相近種屬的動物及其細胞有保護力，對不同種屬的動物及其細胞也可能具有保護作用。如猴的IFN基因不僅對猴有保護作用，對兔和人也有一定的作用。GoIFN-γ除對鵝外，對其它種屬相近的禽類或者其它的脊椎動物也可能具有保護作用。對此本研究團隊將進一步深入研究。