論多肽的固相合成法研究進展

閆鳳

摘要：在生物工程中，對多肽的研究是重要的一項工作內(nèi)容。隨著社會的發(fā)展，合成多肽類生物活性物質(zhì)對于生物工程技術(shù)的發(fā)展有著越來越重要的意義。下文介紹了多肽合成的原理方法和現(xiàn)階段的問題，并對其研究進展作了具體闡述。

關(guān)鍵詞：多肽；固相合成法；生物；氨基酸

引言

多肽是一種由氨基酸組成并廣泛存在于生物體內(nèi)的重要化學物質(zhì)。就目前而言，研究人員已經(jīng)在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)數(shù)萬種多肽物質(zhì)。在實踐中，由于多肽具有良好的安全性和生物活性，所以日益受到生物研發(fā)人員的重視。隨著我國生物工程的發(fā)展和社會經(jīng)濟的進步，多肽固相合成技術(shù)已經(jīng)日臻成熟，其工藝穩(wěn)定性和安全性都有所提高。

1相合成的基本原理

多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，合成一般從C端羧基端）向N端（氨基端）合成。首先將目的肽第一個氨基酸的羧基以共價鍵的形式與固相載體相連，再以這一氨基酸的氨基為合成起點，經(jīng)過脫去氨基保護基并同過量的活化的第二個氨基酸反應，接長肽鏈。重復（縮合→洗滌→去保護→中和及洗滌→進一步縮合）操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽物質(zhì)。

2多肽固相合成法現(xiàn)階段的問題

現(xiàn)階段，雖然經(jīng)過研究人員的不斷改進和完善，多肽固相合成法已經(jīng)能夠合成很多具有生物活性的多肽和蛋白質(zhì)，但其本身還存在著很多問題與缺陷，如直接合成的序列短、所需時間長、合成的效率和純度低、成本高等，這些問題都限制了多肽固相合成法的應用范圍。

2.1合成多肽的序列短

自從BMerrifield發(fā)明了多肽固相合成法后，多肽的化學合成成為蛋白質(zhì)大量重組表達的有效輔助工具，被廣泛應用于結(jié)構(gòu)生物學、免疫學、蛋白質(zhì)工程和生物藥物研究中。盡管在肽鏈合成后的性質(zhì)、分析等方面都有很大提高，但是當肽鏈殘基大于三十個，尤其超過五十個時，肽鏈的合成就會受到一定程度的制約。多肽固相合成被局限于小片段多肽的合成。

2.2合成效率及純度不高

對于富含二硫鍵和堿性氨基酸殘基的多肽固相合成，即使是在30個氨基酸以內(nèi)，仍比較困難，一部分多肽不能成功合成。隨著氨基酸數(shù)量的增加，合成效率逐步下降，非目的肽含量逐步增長，目的肽的純度相應降低，后續(xù)的純化和重復性愈加困難。合成多肽的樹脂和保護氨基酸等原料昂貴，多肽合成的成本高，還不能完全滿足作為藥物商業(yè)化生產(chǎn)的要求。

2.3合成時間長

經(jīng)過幾十多年的發(fā)展，多肽固相合成的速率取得了很大提高，但是相對其他合成方式（如生物合成法）來說，肽鏈的合成速率仍然很慢。每結(jié)合上一個氨基酸大約需要二十到一百二十分鐘，平均一個九肽的合成需要五小時以上。另外，當合成結(jié)構(gòu)較復雜的多肽序列時，鏈的結(jié)合時間更長。

2.4合成試劑的毒性大

DCM、DMF為多肽固相合成的首選試劑，其應用量大、毒性高，對身體及周邊環(huán)境危害大。這些有機化學試劑成為廢液后均需要報環(huán)保局進行處理。在合成過程中應用的儀器大多可在全封閉條件下進行，但其排出的廢氣、廢液等，對環(huán)境仍有一定的污染，不能保證百分百安全。因此，隨著多肽固相合成法的發(fā)展與廣泛應用，國家對研制開發(fā)出新型的、危害小的合成試劑的需求越來越迫切。

3合成方法

3.1Boc合成法

采用三氟乙酸（TFA）可脫除的Boc為α-氨基保護基，側(cè)鏈保護采用芐醇類。合成時將一個Boc保護的α-氨基酸共價交聯(lián)到樹脂上，用TFA脫除Boc，三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過DCC活化、偶聯(lián)下一個氨基酸，最終采用強酸HF法或三氟甲磺酸將合成的目標多肽從樹脂上解離。在Boc合成法中，由于要反復地用酸來脫保護以便進行下一步的偶聯(lián)，這就引入了一些副反應，如多肽容易從樹脂上切除下來，氨基酸側(cè)鏈在酸性條件不穩(wěn)定并發(fā)生副反應。

3.2Fmoc合成法在Fmoc法

研究人員采用了可被堿脫除的Fmoc作為α-氨基酸的保護基，側(cè)鏈采用酸脫除的Boc保護方法。Fmoc作為氨基保護基的優(yōu)點在于它對酸穩(wěn)定，用TFA等試劑處理不受影響，僅需用溫和的堿處理，側(cè)鏈用對堿穩(wěn)的Boc進行保護等。肽段最后用TFA/二氧甲烷定量地從樹脂上切除，避免了采用強酸。Fmoc法與Boc法相比，由于Fmoc法反應條件溫和，副反應少，產(chǎn)率高，而被廣泛應用于多肽合成中。

3.3固相合成的聚合物載體的選擇

將固相合成與其他多肽合成技術(shù)分開來的最主要的特征是固相載體，而能被用作多肽固相載體的聚合物必須滿足以下條件：第一，必須包含合適的連接分子或反應基團，使肽鏈能連接在載體上面，并在以后除去。第二，必須提供足夠的連接點，以滿足肽鏈不斷增長的需要。第三，必須在合成過程中保持穩(wěn)定并且不與氨基酸分子反應。目前用于固相合成的聚合物載體主要有三類：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚乙烯—乙二醇類樹脂及衍生物。這些聚合物載體只有引入相應的連接分子，才能與氨基酸進行連接。根據(jù)連接分子的不同，樹脂又被分為以下幾種：羧基樹脂、氯甲基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。

3.4連接分子

一個理想的連接分子必須在整個合成過程中十分穩(wěn)定，并在合成后可以定量的切割下來而又不破壞合成的目標分子，同時連接分子還需要根據(jù)與樹脂相連的肽的C端的結(jié)構(gòu)類型，裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物來選擇。固相多肽合成使用過的連接分子為含有對苯甲?；?、氯甲基、巰甲基、丁鄰硝基芐醇基及二苯氯硅烷等的雙官能團化合物。

3.5肽鍵的形成

固相中肽鍵的形成原理與液相中的基本一致，應用的方法主要有縮合劑法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，其中DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法由于在肽鍵的形成過程中可以減少副反應并抑制消旋的發(fā)生，最終得到的多肽收率高等優(yōu)點而應用最廣。

3.6多肽的切割與純化

按既定的順序合成完多肽后，就要把目標多肽從樹脂上切割下來，并進行進一步的純化。由于多肽的合成有Boc法和Fmoc法兩種，因此，它們的切割方法也不完全一樣。在Boc法中，主要用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護。在Fmoc法中直接用TFA進行切割。合成肽鏈進一步的精制、分離與純化通常采用親和層析、高效液相色譜、毛細管電泳等方法來實現(xiàn)。

結(jié)束語

多肽固相合成法自研究以來，已經(jīng)在工藝上了很大改進，隨著人們對生物化學領(lǐng)域關(guān)注度的增高，多肽固相合成法研究工作的重要性日益凸顯了出來。研究人員如何進一步優(yōu)化其純度，有效去除雜質(zhì)是研究工作的重點內(nèi)容。多肽雜質(zhì)譜具有比較高的復雜性，為此，研究人員需結(jié)合多肽的結(jié)構(gòu)特點，加強固相合成工藝研究與控制，建立相應的研究控制策略，盡可能地降低潛在雜質(zhì)的生成，保證多肽產(chǎn)品的質(zhì)量。

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