不同甘薯品種莖葉中多糖含量的測定分析

趙 珊 ，馮俊彥 ，李 曦 ，雷欣宇 ，仲伶俐 ，周 虹 ，黃世群 ，羅 玲 ，譚文芳 ，張 聰

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川 成都 610061；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，四川 成都 610066）

多糖又稱多聚糖，是由10個以上結(jié)構(gòu)相同或不同的單糖以糖苷鍵結(jié)合而成的高分子化合物，廣泛存在于高等植物、藻類、微生物及動物體內(nèi)。隨著近年來對多糖及其復(fù)合物研究的不斷深入，其具有的抗腫瘤、消炎、抗病毒、降血糖、降血脂、抗衰老、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等方面的活性功能逐漸被發(fā)現(xiàn)[1-5]。

甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam.）是我國重要的糧食、飼料、工業(yè)原料和生物質(zhì)能源作物，是世界第七大糧食作物[6]。菜用甘薯是指以甘薯嫩梢或葉柄作為食用部位的一種蔬菜專用型甘薯新品種，其莖尖中富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、多糖、黃酮、多酚類物質(zhì)、多種維生素以及礦物質(zhì)，保健功效顯著[7]。甘薯多糖目前研究主要集中在多糖的提取、組分分析和生物活性等方面。甘薯多糖是甘薯中重要的活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、降血壓等生物活性[8]。

目前，常用的多糖含量測定方法有苯酚-硫酸法[9-14]和蒽酮-硫酸法[15-17]。本試驗比較了苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法在甘薯莖葉多糖測定中的測定效果，為建立準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好的甘薯莖葉多糖含量測定方法提供依據(jù)；同時比較了15份菜用甘薯和2份鮮食甘薯材料中葉片、葉柄和莖的多糖含量，旨在為多糖的提取應(yīng)用和甘薯育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

供試15份菜用甘薯品種和2份鮮食甘薯品種分別由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所和四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所提供。材料栽種于2017年4月，采集于2017年7月。具體材料選育和來源信息如表1所示。

葡萄糖（≥98%，sigma），無水乙醇、蒽酮、苯酚、濃硫酸均為國產(chǎn)分析純。

表1 材料名稱及來源信息

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計（UV2550，日本島津）；超聲提取器；水浴鍋；電熱鼓風(fēng)干燥箱；十萬分之一電子天平；實驗室純水儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的提取 將新鮮的甘薯地上部分莖葉按葉、葉柄、莖分別取下，在50℃下烘干后粉碎過20 mm篩備用。稱取0.50 g樣品于50 mL具塞離心管中，用5 mL水浸潤樣品，再緩慢加入20 mL無水乙醇，同時使用渦旋振蕩器混合均勻，置于超聲提取器中超聲30 min，提取后離心去掉上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇再洗滌一次，用50 mL蒸餾水將上述不溶物轉(zhuǎn)移到250 mL具塞三角瓶中，于沸水浴中提取2 h。之后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并用蒸餾水定容。過濾后的濾液為樣品測定液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取0.100 0 g 105℃干燥4 h的葡萄糖于100 mL燒杯中，加水溶解定容至1 000 mL，即配成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲備溶液。

1.3.3 苯酚-硫酸法顯色反應(yīng)

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別吸取0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲備液于10 mL比色管中，用蒸餾水補至1.0 mL。加入1.0 mL5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸，充分混勻后于30℃水浴中反應(yīng)20 min，在486 nm處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 樣品測定 吸取0.20 mL樣品溶液于10 mL比色管中，用蒸餾水補至1.0 mL。加入1.0 mL5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸，充分混勻后于30℃水浴中反應(yīng)20 min，在486 nm處測定吸光度。

1.3.4 蒽酮-硫酸法顯色反應(yīng)

1.3.4.1 蒽酮試劑配制 稱取0.10 g蒽酮，用100 mL 80%濃硫酸溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別吸取0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲備液于10 mL比色管中，用蒸餾水補至1.0mL。立即加入蒽酮試劑6.0mL，振蕩混勻后置于沸水浴中加熱15 min，然后迅速置于冰水浴中冷卻15 min，在625 nm處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3 樣品測定 吸取0.20 mL樣品溶液于10 mL比色管中，用蒸餾水補至1.0 mL。立即加入蒽酮試劑6.0 mL，振蕩混勻后置于沸水浴中加熱15 min，然后迅速置于冰水浴中冷卻15 min，在625 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯莖葉沸水浴時間的確定

選取甘薯葉在沸水浴時，分別做4組樣品，每組3 個平行，4 組沸水浴時間分別為 0.5，1，2，3 h。提取的甘薯葉多糖用苯酚-硫酸法測定平均含量分別為2.23%，2.67%，3.39%和3.30%（圖1）。從圖1可以看出，沸水浴時間2 h時，甘薯葉多糖的含量最高。

2.2 最大吸收波長的確定

2.2.1 苯酚-硫酸法 分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和甘薯葉片、葉柄、莖樣品溶液各1.0 mL，以1.0 mL蒸餾水作為空白，按照1.3.3的顯色方法操作，在400～900 nm區(qū)域掃描吸收曲線。從圖2可以看出，在苯酚-硫酸法測定葡萄糖和甘薯莖葉多糖的試驗中，葡萄糖在486.0 nm波長處有明顯的最大吸收峰，甘薯葉片、葉柄、莖的多糖分別在482.0，486.0，485.5 nm波長處有最大吸收峰，其余波段無干擾峰的存在。因此，選取486 nm波長作為苯酚-硫酸法的檢測波長。

2.2.2 蒽酮-硫酸法 分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和甘薯葉片、葉柄、莖樣品溶液各1.0 mL，以1.0 mL蒸餾水作為空白，按照1.3.4的顯色方法操作，在400～900 nm區(qū)域掃描吸收曲線。掃描結(jié)果如圖3所示。由此可見，在蒽酮-硫酸法測定葡萄糖和甘薯莖葉多糖的試驗中，葡萄糖在623.0 nm波長處有明顯的最大吸收峰，甘薯葉片、葉柄、莖中多糖分別在621.5，626.5，627.0 nm波長處有最大吸收峰。因此，選取625 nm波長作為蒽酮-硫酸法的檢測波長。但此方法葡萄糖和甘薯葉多糖在400～900 nm區(qū)域波長變化較多，在507，625 nm附近分別出現(xiàn)了較高的吸收峰。

2.3 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法線性范圍、穩(wěn)定性和精密度試驗

苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程列于表2，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 7和0.999 1。表明這2種方法葡萄糖在0～100 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

吸取甘薯葉多糖樣品溶液0.2 mL，加水補齊至1.0 mL，以1.0 mL蒸餾水作為空白，分別采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法進行顯色反應(yīng)，在486，625 nm處每隔10 min測定一次吸光度（表3）。由表3可知，在60 min內(nèi)對2種顯色方法的吸光度的變化進行考察。苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.34%和2.57%，可見苯酚-硫酸法較蒽酮-硫酸法表現(xiàn)更為穩(wěn)定。

分別平行取6份甘薯葉多糖樣品溶液0.2 mL，加水補齊至1.0 mL，以1.0 mL蒸餾水作為空白，采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法進行顯色反應(yīng)，分別在486，625 nm處測定吸光度值，RSD分別為0.96%，2.93%（表 2）。

表2 方法的線性關(guān)系及精密度試驗

表3 方法的穩(wěn)定性試驗

2.4 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法回收率試驗

精密移取甘薯葉片、葉柄和莖的樣品溶液12份，分成4組裝于比色管中，每組分別加入100mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00，0.20，0.40，0.60mL。采用苯酚 -硫酸法和蒽酮-硫酸法測定其吸光度，分別計算其加標(biāo)回收率，結(jié)果如表4所示。苯酚-硫酸法回收率在87.3%～103.1%，RSD在0.08%～1.73%。蒽酮-硫酸法回收率在87.4%～101.2%，RSD在0.81%～3.59%。回收率試驗結(jié)果表明，這2個方法均可用于甘薯葉、葉柄和莖多糖含量的測定。

表4 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法加標(biāo)回收率（n＝3）

2.5 樣品的測定

分別采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法對17份甘薯材料的葉片、葉柄和莖中多糖含量進行測定，每個樣品平行測定3次，測定結(jié)果如表5所示。

苯酚-硫酸法的測定結(jié)果表明，17份甘薯葉片多糖的含量為3.00%～4.84%；葉柄多糖的含量為2.34%～4.21%；莖多糖的含量為1.98%～3.63%；其中含量相對最高的材料是坦桑尼亞。蒽酮-硫酸法的測定結(jié)果顯示，17份甘薯葉片多糖的含量為1.11%～2.52%；葉柄多糖的含量為1.37%～2.85%；莖多糖的含量為1.26%～2.69%；其中含量相對最高的材料是泉薯830。

通過比較2種顯色方法測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表5），苯酚-硫酸法測定甘薯葉片、葉柄和莖中多糖含量普遍高于蒽酮-硫酸法，其中葉片的差異最大。苯酚-硫酸法的測定結(jié)果表明，葉片多糖的含量高于葉柄和莖。蒽酮-硫酸法結(jié)果表明，葉柄和莖的含量高于葉片。在最大吸收波長掃描的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，蒽酮-硫酸法在507，625 nm附近分別出現(xiàn)了較高的吸收峰，特別是甘薯葉片在507 nm附近的吸收峰還高于621.5 nm的吸收峰，甘薯葉柄和莖在507，625 nm附近有相近強度的吸收峰。而苯酚-硫酸法只在486 nm波長附近處有最大吸收峰，其余波段無干擾峰的存在，說明甘薯多糖在苯酚-硫酸作用下生成衍生物組分比較單一，顯色效果好。這有可能是在甘薯葉片多糖含量的測定結(jié)果中蒽酮-硫酸法遠(yuǎn)低于苯酚-硫酸法的一部分原因。另外，在穩(wěn)定性、精密度以及回收率試驗上蒽酮-硫酸法的RSD均高于苯酚-硫酸法。因此，認(rèn)為苯酚-硫酸法在穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性上均優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

表5 甘薯葉片、葉柄和莖中多糖的含量

羅霞等[18]采用蒽酮-硫酸法測定甘薯藤蔓多糖的范圍為2.63%～5.95%。王憲昌等[19]研究發(fā)現(xiàn)，甘薯生長期莖蔓和成熟期莖蔓的多糖含量分別為5.33%和4.22%。丁文等[20]采用蒽酮-硫酸法研究發(fā)現(xiàn)，甘薯嫩莖、老莖和葉中多糖含量分別為6.12%，4.47%和2.09%。本試驗采用蒽酮-硫酸法測定甘薯葉、葉柄和莖的結(jié)果為1.11%～2.85%，結(jié)果比之前的研究偏低，其原因可能與試驗材料不同有關(guān)；此外，王憲昌等[19]、丁文等[20]都是測定初步提純后的甘薯多糖，有可能直接提取測定雜質(zhì)對顯色有干擾，所以，與純化后測定甘薯多糖結(jié)果有一定的差異。因此，推測蒽酮-硫酸法測定甘薯莖葉多糖更適用于提純?nèi)コs質(zhì)后的樣品。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了甘薯莖葉多糖的提取方法，比較了苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法對甘薯多糖的測定結(jié)果。通過比較沸水浴時間與多糖含量測定的關(guān)系，確定了最優(yōu)沸水浴時間為2 h。采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法這2種顯色方法對甘薯葉片、葉柄和莖多糖的含量測定進行了比較，在最大吸收波長掃描、線性關(guān)系的考察、穩(wěn)定性試驗、精密度試驗以及回收率試驗上進行比較。確定苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的檢測波長分別為486，625 nm，表明苯酚-硫酸法在穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性上均優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

通過與前人的研究結(jié)果進行比較分析發(fā)現(xiàn)，本研究采用蒽酮-硫酸法測定甘薯莖葉多糖的結(jié)果比之前的研究結(jié)果偏低，原因可能與材料差異以及在顯色過程中雜質(zhì)的干擾有關(guān)。本研究推測蒽酮-硫酸法測定甘薯莖葉多糖更適用于提純?nèi)コs質(zhì)后的樣品。

［1］GONZAGA ML C，RICARDO N MP S，HEATLEY F，et al.Isolation and characterization of polysaccharides from Agaricus blazei Murill[J].Carbohydrate Polymers，2005，60（1）：43-49.

［2］KOH J H，KIMKM，KIMJ M，et al.Antifatigue and antistress effect of the hot-water fraction frommycelia of Cordyceps sinensis[J].Biological&Pharmaceutical Bulletin，2003，26（5）：691-694.

［3］馬歡杰.多糖類抗腫瘤作用的研究進展 [J].海峽藥學(xué)，2010，22（2）：102-104.

［4］王蓉，吳劍波.多糖生物活性的研究進展[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊），2001，22（3）：97-100.

［5］趙東賢，王克霞，李朝品.多糖抗病毒作用的研究進展[J].熱帶病與寄生蟲學(xué)，2009，7（3）：174-176.

［6］馬代夫，李強，曹清河，等.中國甘薯產(chǎn)業(yè)及產(chǎn)業(yè)技術(shù)的發(fā)展與展望[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28（5）：969-973.

［7］郭小丁，張允剛，史新敏.菜用型甘薯嫩梢的開發(fā)利用[J].中國蔬菜，2001（4）：40-41.

［8］孫健，周波，鈕福祥，等.甘薯多糖國內(nèi)外研究進展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28（8）：90-93.

［9］白瑞斌，馬玉玲，張培，等.苯酚-硫酸法結(jié)合校正因子法測定含半乳糖醛酸的多糖中的糖含量 [J].中國藥房，2017，28（21）：2974-2978.

［10］邵尉，姜秀梅，曹雪原，等.不同光照條件、不同采收時間對鐵皮石斛總多糖、還原性糖以及甘露糖含量的影響[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2017，31（4）：20-22.

［11］吳菲菲，李化強，趙良忠，等.青錢柳多糖的體外抗氧化活性評價[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2017，8（8）：3044-3049.

［12］胡榮.零售山茱萸藥材多糖含量測定 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（7）：834-836.

［13］趙愛玲，李登科，王永康，等.棗樹不同品種、發(fā)育時期和器官的水溶性多糖含量研究 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：1040-1043.

［14］孫紅亮，辛彩云，許慶琴，等.山西產(chǎn)不同品種枸杞子多糖和微量元素含量比較[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（12）：1276-1278.

［15］李雪珍，郭家文.蒽酮濃硫酸法測定多糖含量顯色條件的研究[J].中國糖料，2017，39（2）：15-17.

［16］張華，王紅艷，陳品，等.正交試驗優(yōu)化微波輔助提取甘孜川貝粗多糖的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（5）：187-190.

［17］劉忠宇，杜靜，王瑜.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取冬蟲夏草多糖工藝研究[J].現(xiàn)代食品，2016（22）：111-117.

［18］羅霞，魏巍，余夢瑤，等.不同品種甘薯藤蔓部分活性成分含量的比較[J].食品科學(xué)，2013，34（10）：238-240.

［19］王憲昌，呼曉姝，王建中.甘薯莖蔓多糖提取技術(shù)及不同時期多糖含量比較[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，37（2）：204-207.

［20］丁文，于華忠，黃維，等.紅薯葉、莖中多糖的提取及含量測定[J].中國林副特產(chǎn)，2006（6）：20-21.