大豆脂肪氧化酶研究進(jìn)展

劉 博 ，衛(wèi) 玲 ，肖俊紅 ，楊海峰 ，段學(xué)艷 ，陳愛萍 ，任瑞蘭 ，肖 磊

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西 臨汾 041000；2.邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 邯鄲 056001）

脂肪氧化酶是一類含非血紅素鐵、不含硫的過氧化酶，球型，可溶，無色，其分子量在動物中為75～80 ku，植物中為90～104 ku，其在動植物和微生物中普遍存在，在真核細(xì)胞生物中參與不飽和脂肪酸的代謝[1-5]。

1932年，脂肪氧化酶（簡稱Lox）首次在大豆中被發(fā)現(xiàn)[6]，它僅占大豆總蛋白的1%～2%[7]，但是能夠?qū)Ｒ淮呋嘣伙柡椭舅岬募友醴磻?yīng)，形成具有共軛雙鍵脂肪酸氫過氧化物。這些產(chǎn)物經(jīng)過解裂酶分解，產(chǎn)生醇、酮、醛類等揮發(fā)性物質(zhì)，進(jìn)而形成豆腥味[8-10]。脂肪氧化酶及其代謝產(chǎn)物一方面在植物營養(yǎng)生長、防御反應(yīng)、抗逆性等方面具有積極作用；另一方面造成了豆腥味等不良?xì)馕懂a(chǎn)生、降低了大豆的營養(yǎng)品質(zhì)，在一定程度上縮短了大豆的儲藏期。因此，研究大豆脂肪氧化酶具有非常重要的意義。

從遺傳機(jī)制及育種改良、檢測技術(shù)與手段方面綜述了大豆脂肪氧化酶的研究進(jìn)展，旨在為相關(guān)研究提供借鑒和參考。

1 脂肪氧化酶遺傳機(jī)制及育種改良

1.1 國外研究

20世紀(jì)40年代和70年代，THEORELL等[11-13]先后分離純化了大豆脂肪氧化酶的3種同工酶Lox1，Lox2 和 Lox3 （Lox3a，Lox3b），其中，Lox3a，Lox3b在許多性質(zhì)上相似，被認(rèn)為是同一種同工酶。3種酶同源性較高，同源序列中N末端均有氨基酸組成的桶狀結(jié)構(gòu)，C末端均有一段氨基酸保守區(qū)域，該區(qū)域作為酶蛋白活性中心，從而調(diào)節(jié)酶活性。當(dāng)3種酶對應(yīng)基因均為隱性（即lx1，lx2，lx3）時，Lox1，Lox2和Lox3全缺失，豆腥味全無。前人研究表明，lx1與lx2緊密連鎖，lx3獨(dú)立遺傳[14]。

1995年，日本學(xué)者NISHIBA等[15]用正常大豆與各類型Lox缺失體比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水狀均質(zhì)豆粉中脂肪酸過氧化作用指標(biāo)（DETBA值）和己醛生成量最低值均為Lox全缺失體。NISHIBA等[16]研究加水均質(zhì)豆粉及豆奶維生素E含量、清除自由基（DPPH）活性的品種間差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lox全缺失體有最高水平的維生素E含量和清除DPPH自由基活性，說明Lox全缺失體具有更高的營養(yǎng)價(jià)值。目前，國外報(bào)道，篩選出了3種類型Lox自然缺失體，并育成了以美國Century、日本Suzuyutaka近等基因系為代表的品種或種質(zhì)資源，用于研究和育種。比較典型的有日本育成的低豆腥味品種“夢豐”，無豆腥味品種“中育37”，韓國育成的“真品豆”等。

1.2 國內(nèi)研究

我國對脂肪氧化酶研究相對較晚。1994年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所丁安林等[13]首先開展大豆種子脂肪氧化酶、同工酶缺失體的研究。之后，傅翠真等[17]對我國大豆脂肪氧化酶缺失種質(zhì)多樣性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的Lox缺失類型為Lox1，Lox2，Lox3和Lox2.3，共4種。麻浩等[18]對不同Lox缺失體近等基因系豆腥味研究結(jié)果表明，3種酶對豆腥味貢獻(xiàn)程度大小為Lox2＞Lox1＞Lox3，即Lox2作用最大，Lox1作用居中，Lox3作用最小。

我國大豆研究人員在“九五”期間，建立了大豆脂肪氧化酶缺失突變基因（lx）的蛋白標(biāo)記和lx1的RAPD標(biāo)記1個，lx2和lx3的特異PCR標(biāo)記各1個，并用這些分子標(biāo)記輔助育種，育成了低豆腥味大豆新品種中黃 18（Lox2缺失）、中黃 16（Lox2.3，Ti缺失）、無腥1號（Lox2.3缺失）和一批Lox雙缺的品種或種質(zhì)。劉藝苓[19]運(yùn)用基因工程手段，克隆大豆脂肪氧化酶基因，同時采用種子特異型啟動子構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，以期抑制大豆脂肪氧化酶基因的表達(dá)，最終降低脂肪氧化酶的含量。馬建[20]將RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于改良大豆脂肪氧化酶含量，取得了良好效果，獲得了脂肪氧化酶含量明顯降低、脂肪含量明顯提高的轉(zhuǎn)基因大豆植株，克服了常規(guī)育種易受種質(zhì)資源限制和育種時間長的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了大豆育種方法的創(chuàng)新。趙艷等[21]從大豆基因組DNA中分離脂肪氧化酶-3基因啟動子片段Lox3p，其利用PLACE在線啟動子預(yù)測工具分析發(fā)現(xiàn)，序列中含有多種典型的種子及胚特異性表達(dá)元件，將克隆得到的Lox3p片段構(gòu)建表達(dá)載體pCAM-Lox3p，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在大豆種子中進(jìn)行瞬時表達(dá)，GUS組織化學(xué)染色和熒光測定都顯示，Lox3p驅(qū)動GUS基因表達(dá)的強(qiáng)度高于CaMV35S啟動子，結(jié)果表明，Lox3p啟動子片段具備一定的胚特異表達(dá)特性。王丹等[22]應(yīng)用RNA干擾技術(shù)同時抑制大豆脂肪氧化酶（Lox）和胰蛋白酶抑制劑（KTi）基因的表達(dá)，改良大豆品質(zhì)，培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。

在育種方面，河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油研究所使用美國Century和日本Suzuyutaka脂肪氧化酶缺失近等基因系培育出五星1號、五星2號、五星3號、五星4號、冀豆12-2、冀豆12-3、冀豆12-2.3、冀豆12-3L、冀豆9號-3L等系列脂氧酶缺失優(yōu)異品種（種質(zhì)），該系列母本為當(dāng)?shù)仄贩N，父本為美國和日本來源的脂肪氧化酶缺失種質(zhì)。其中，五星4號為我國第1個脂肪氧化酶全缺失的無腥味大豆審定品種[23]。國內(nèi)其他科研院所也積極開展相關(guān)方面的研究，其中，黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏化研究所育成了綏無腥豆1號；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所大豆研究室研究人員以抗病、高產(chǎn)、廣適的魯豆4號為母本，以美國種質(zhì)Century為父本，育成了無豆腥味優(yōu)質(zhì)大豆魯93125-4；河南省科研人員育成中特1號、鄭優(yōu)1號等。目前，國內(nèi)大豆脂肪氧化酶研究已取得了不少成績，育成了一定數(shù)量品種。

2 脂肪氧化酶檢測技術(shù)和方法

脂肪氧化酶檢測技術(shù)除了常規(guī)品嘗，還有一些方法：張瑛等[24]利用脂肪氧化酶的偶聯(lián)氧化還原指示劑而顯色快速檢測植物脂肪氧化酶，該技術(shù)具有操作簡便、快速，結(jié)果直觀、準(zhǔn)確，能進(jìn)行定性和定量分析；吳培培等[25]利用紫外分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀測定脂肪氧化酶活性，同時利用控制脂肪氧化酶活性位點(diǎn)的緊密連鎖的分子標(biāo)記Xwmc312以及功能標(biāo)記 LOX16和 LOX18，采用PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳分離技術(shù)進(jìn)行參試材料的LOX基因型鑒定。

3 脂肪氧化酶缺失對大豆貯藏的影響

王若蘭等[26]對8個脂肪氧化酶不同程度缺失大豆品種和1個正常大豆品種進(jìn)行了40℃耐高溫存貯品質(zhì)變化試驗(yàn)，結(jié)果表明，脂肪氧化酶缺失品種相同的存貯時間后，其發(fā)芽率、粗脂肪含量、水溶性氮指數(shù)均高于普通品種，脂肪酸成分變化和色澤優(yōu)于普通品種，脂肪酸值和過氧化值低于普通品種。由此可見，脂肪氧化酶缺失確實(shí)有利于大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)的保護(hù)，有利于延長大豆保質(zhì)期。這可能是由于正常品種中存在脂肪氧化酶，能催化細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸和脂肪酸氧化，形成脂肪酸氫過氧化物和自由基，造成細(xì)胞膜通透性增加等危害，進(jìn)而對貯藏造成不利影響[27]。

4 結(jié)論與展望

供給側(cè)改革要求體現(xiàn)到大豆生產(chǎn)方面，除了要保證產(chǎn)量，還需要提高品質(zhì)，市場對無腥大豆有較大需求。無腥大豆在育種、生產(chǎn)、生活、大豆精深加工產(chǎn)業(yè)等方面的研究具有廣闊的應(yīng)用前景。脂肪氧化酶缺失品種培養(yǎng)和研究，作為從根本上消除豆腥味的方法，對提高大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)、改善風(fēng)味、簡化精深加工程序、降低加工成本、延長貯藏期等方面具有重要意義。

目前，對大豆脂肪氧化酶遺傳規(guī)律的研究較清楚，但對具體調(diào)控作用機(jī)制及與其他性狀關(guān)系等方面不甚了解。已報(bào)道的檢測脂肪氧化酶的方法和手段、程序和操作逐漸簡化，成本逐漸下降。今后種質(zhì)改良方面，應(yīng)充分重視現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，除了通過開發(fā)功能標(biāo)記（標(biāo)簽）或緊密連鎖分子標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種、設(shè)計(jì)育種外，可使用RNA干擾、基因編輯技術(shù)提高育種效率。具有優(yōu)良性狀的基因組編輯大豆產(chǎn)品已逐步從實(shí)驗(yàn)室走向田間，并展現(xiàn)了較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因作物更為優(yōu)越的應(yīng)用前景[28]。同時，不可偏廢常規(guī)雜交育種技術(shù)應(yīng)用。檢測方面，可嘗試探索表觀（宏觀）性狀與脂肪氧化酶缺失關(guān)系，通過簡單的表觀性狀（甚至品嘗吃味）等標(biāo)準(zhǔn)建立，篩選脂肪氧化酶缺失品種（種質(zhì)），創(chuàng)造更為簡單、可靠、可行、低成本的檢測篩選方法和技術(shù)。

應(yīng)積極開展針對當(dāng)?shù)靥囟ㄉ鷳B(tài)環(huán)境、生產(chǎn)條件和加工需求的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的脂肪氧化酶缺失種質(zhì)（品種）研究與應(yīng)用，解決大豆的地區(qū)適應(yīng)性較明顯帶來的直接引種造成的局限性和風(fēng)險(xiǎn)。

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