抗EPO抗體特性、分類及其相關(guān)純紅細(xì)胞再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制及診治進(jìn)展

張 晶 綜述 張承英 審校

抗EPO抗體相關(guān)純紅細(xì)胞再生障礙性貧血是一種應(yīng)用重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)而引起的純紅細(xì)胞再生障礙性貧血(pure red cell aplasia，PRCA)，臨床上比較少見，其主要特點(diǎn)為rHuEPO治療無(wú)效，呈進(jìn)行性貧血，特點(diǎn)為外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞及骨髓中紅系前體細(xì)胞絕對(duì)缺乏，而粒系和巨核系細(xì)胞數(shù)正常。1922年，Kaznelson首次將PRCA從再生障礙性貧血中分出。本病臨床上并不常見，其發(fā)病率約占再生障礙性貧血總數(shù)的3%[1]。隨著rhuEPO在臨床的廣泛應(yīng)用，由其引起的不良反應(yīng)—抗EPO抗體相關(guān)純紅細(xì)胞再生障礙性貧血也越來(lái)越受到臨床重視。筆者重點(diǎn)對(duì)該病的發(fā)病機(jī)制、診斷及治療進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 抗EPO抗體

1.1 特性 促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是由腎皮質(zhì)腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞和肝臟分泌的一種酸性糖蛋白，用于骨髓中紅系造血祖細(xì)胞，能促進(jìn)其增殖、分化。它由分子量為18 399的166個(gè)氨基酸的成熟蛋白組成，其分子量約為30 400。人類EPO 基因定位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂22區(qū)(7q22)，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，細(xì)胞在分泌外顯子編碼的多肽時(shí)，將N-端27個(gè)氨基酸組成的前導(dǎo)肽剪切下來(lái)，經(jīng)過移除末端氨基酸，在體內(nèi)與骨髓紅系前體細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合，抑制骨髓紅系前體細(xì)胞的凋亡，刺激骨髓紅細(xì)胞的生成和釋放，從而發(fā)揮生物學(xué)作用。1983年由Lin等[2]成功分離并克隆了EPO基因，1985年成功地克隆出人EPO互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)和基因，開始利用基因工程技術(shù)表達(dá)了重組人EPO，即rHuEPO，并之后用于臨床實(shí)驗(yàn)，1989年美國(guó)食品藥品管理局(FDA)正式批準(zhǔn)rhuEPO 應(yīng)用于貧血的臨床治療。目前隨著現(xiàn)代基因技術(shù)的發(fā)展，r-HuEPO已成功廣泛應(yīng)用于臨床慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者，有研究顯示，慢性腎臟病患者對(duì)EPO反應(yīng)性的降低是疾病進(jìn)展的主要原因，體內(nèi)炎性反應(yīng)因子也能不同程度地降低機(jī)體對(duì)EPO的反應(yīng)性[3]，所以說(shuō)EPO可顯著延緩慢性腎臟病的進(jìn)展[4-6]。此外，EPO還適用于癌癥、化療或者外科手術(shù)中異性輸血導(dǎo)致的貧血、失血后貧血和AIDS引起的貧血等，也可降低患者對(duì)輸血的需求，減少AIDS及病毒性肝炎等通過血液制品傳播疾病的發(fā)生幾率。

1.2 分類 臨床使用最廣的rHuEPO均為EPO基因經(jīng)過體外重組后在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白，糖基對(duì)穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)和生物活性非常重要，各種類型的rHuEPO氨基酸序列與天然EPO之間最主要區(qū)別為所含寡糖鏈的不同。rHuEPO可分為含寡糖39%的rHuEPO-α和含寡糖24%的rHuEPO-β，而抗EPO抗體介導(dǎo)的PRCA主要發(fā)生于前者。PRCA可分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性常與形態(tài)異常有關(guān)，由編碼各種核糖體蛋白質(zhì)的基因發(fā)生突變而導(dǎo)致[7]，繼發(fā)性可見于腫瘤(如胸腺瘤、淋巴瘤等)、病毒感染(肝炎病毒等)、自身免疫性疾病、藥物(如氯霉素、異煙肼、硫唑嘌呤等)、妊娠及rHuEPO相關(guān)等[8-10]，其原因可能跟T淋巴細(xì)胞功能異常，細(xì)胞因子分泌紊亂，致使骨髓產(chǎn)生受抑制有關(guān)[11，12]。

2 PRCA發(fā)病機(jī)制

目前，抗EPO抗體相關(guān)的PRCA發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)制可能有以下方面：(1)給藥途徑。EPO相關(guān)PRCA患者的給藥途徑幾乎均為皮下注射。其局部皮膚可出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)，從而促使全身免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，因?yàn)榱馨图?xì)胞在皮下，與靜脈給藥相比，皮下注射更易增加藥物的免疫原性，從而介導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)[13]，但皮下注射EPO依然有其生物利用度高，減少過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。(2)穩(wěn)定劑成分。1998年為防止瘋牛病等疾病的傳播， Epre等[14]使用聚山梨醇酯80代替白蛋白做為穩(wěn)定劑成分，之后 EPO相關(guān)的PRCA發(fā)病數(shù)量也升高，由此推測(cè)EPO抗體產(chǎn)生與穩(wěn)定劑聚山梨醇酯有關(guān)，尤其是溫度較高時(shí)，會(huì)引起rhuEPO分子聚集形成微粒，進(jìn)入體內(nèi)后觸發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，引起EPO 抗原性改變，從而誘導(dǎo)抗EPO抗體的產(chǎn)生，PRCA多見于使用rHuEPO-α患者，這可能是因?yàn)閞HuEPO-α所含的聚山梨醇酯較rHuEPO-β高[15]，當(dāng)然也有皮下注射rHuEPO-β，如達(dá)依泊汀或HX575后患PRCA的病例[16]。(3)產(chǎn)品包裝。使用帶有無(wú)涂層橡皮塞(uncoated rubber stopper)的預(yù)充型Eprex也和rHuEPO相關(guān)的PRCA有關(guān)。研究認(rèn)為，無(wú)涂層橡皮塞中的某種有機(jī)化合物(鎢或硅)能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊形成聚合物，這對(duì)Eprex免疫原性的增加起到輔助作用，所以臨床建議使用帶有涂層橡皮塞的預(yù)充型Eprex，強(qiáng)化低溫鏈以及改變應(yīng)用途徑。(4)其他因素。除上述原因，如透析管路、透析器，透析患者的微炎癥狀態(tài)，營(yíng)養(yǎng)不良、電解質(zhì)平衡紊亂，透析不充分，ACEI及ARB類藥物及免疫抑制劑的使用，脾亢及甲狀腺功能減退都能影響EPO抗體的產(chǎn)生。

3 診斷和治療

3.1 EPO相關(guān)的PRCA診斷 EPO抗體相關(guān)PRCA的診斷除臨床表現(xiàn)為應(yīng)用rhuEPO過程中存在進(jìn)行性貧血外，還要依靠骨髓象和血清抗EPO抗體的檢查。其診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)持續(xù)使用rHuEPO治療4周以上，在rHuEPO劑量不變或劑量增加時(shí)出現(xiàn)血紅蛋白以每周 5～10 g/L的速度快速下降，或需每周輸入1～2單位的紅細(xì)胞才能維持血紅蛋白水平。需排除透析不完全、缺造血原料等導(dǎo)致促紅細(xì)胞生成素治療反應(yīng)低下的因素；(2)骨髓穿刺提示紅系祖細(xì)胞小于5%，粒系和巨核系無(wú)明顯改變；(3)化驗(yàn)抗EPO抗體陽(yáng)性。同時(shí)滿足以上3項(xiàng)即可診斷為PRCA。Slominski等[17]研究發(fā)現(xiàn)，血清中即使存在抗EPO抗體不一定會(huì)發(fā)生PRCA，抗EPO抗體所導(dǎo)致的PRCA患者也不一定應(yīng)用過rHuEPO。

測(cè)定血清中EPO抗體水平，可了解其發(fā)病機(jī)制，同時(shí)可為糾正患者貧血癥狀提供依據(jù)。EPO抗體的檢測(cè)是診斷EPO相關(guān)的PRCA的重要依據(jù)。目前檢測(cè)血清中抗EPO抗體有多種方法：(1)放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)是最早出現(xiàn)、最精確的檢測(cè)方法，特異性高，但易出現(xiàn)假陰性；(2)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)應(yīng)用廣泛，但其靈敏度和特異性均低于RIPA；(3)生物傳感器免疫分析法(Biosensor immunoassay)操作復(fù)雜，靈敏度低，應(yīng)用受限；(4)體外分析法是最直接的檢測(cè)方法，但不能精確分析抗體滴度及亞型。近年新興的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法(Light initiated chemiluminescence assay，LiCA)展示了未來(lái)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、性質(zhì)穩(wěn)定、易于微型化自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)。

3.2 治療 本病一旦確診后治療上首先應(yīng)停用或避免應(yīng)用所有種類的rhuEPO，并對(duì)嚴(yán)重貧血患者進(jìn)行輸血對(duì)癥治療，治療緩解后仍應(yīng)繼續(xù)停用 EPO 以免復(fù)發(fā)。Verhelst等[18]發(fā)現(xiàn)，除停EPO治療外，給予免疫抑制劑治療后，78%PRCA患者的抗EPO抗體轉(zhuǎn)陰，血紅蛋白較前有所升高。有文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)孢素治療PRCA有效率為82%,是目前公認(rèn)的治療繼發(fā)性PRCA首選藥，其機(jī)制可能是由于環(huán)孢素可逆性地抑制體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的功能和增殖，抑制淋巴因子的生成和釋放，調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群比例，同時(shí)可抑制 CD8 細(xì)胞活性及增殖，使 CD4/CD8 的比例恢復(fù)正常，繼而有效抑制骨髓造血，提高對(duì)激素的敏感性，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。兩藥聯(lián)合應(yīng)用可從各個(gè)方面排除各種免疫異常因素，療效要大于單藥治療。但應(yīng)注意長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑會(huì)致免疫功能低下，易合并各種感染，治療過程中要監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞亞群。我院有報(bào)道顯示腎移植術(shù)后聯(lián)用嗎替麥考酚酯和他克莫司導(dǎo)致PRCA的病例，換用環(huán)孢素后骨髓涂片及血常規(guī)恢復(fù)正常[19]，也有部分報(bào)道顯示僅使用少量激素(潑尼松龍0.2 mg/kg)維持3個(gè)月病情得到緩解的病例[20]。Hirokawa等[21]報(bào)道 PRCA的患者初始免疫抑制治療緩解率顯著要高于復(fù)發(fā)后2次免疫抑制治療緩解率，治療中尤其要注意患者初始的病因治療及針對(duì)發(fā)病機(jī)制的免疫抑制治療，防止2次復(fù)發(fā)。采用腎移植治療PRCA患者緩解率達(dá)100%，其療程也在1個(gè)月內(nèi)，提示腎移植治療方案非?？尚?，但因腎源缺乏，腎移植治療PRCA受到限制，此時(shí)可單用環(huán)孢素、環(huán)孢素+激素、激素+環(huán)磷酰胺進(jìn)行治療，治療應(yīng)一直持續(xù)到復(fù)查抗EPO抗體轉(zhuǎn)為陰性，網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)>20×109/L。近期我院1例PRCA患者經(jīng)激素聯(lián)合環(huán)孢素治療，3個(gè)月內(nèi)血紅蛋白恢復(fù)正常，化驗(yàn)環(huán)孢素谷濃度平均為132.5 ng/ml，取得了比較好的治療效果。此外，大劑量靜注人血免疫丙種球蛋白(HD-IVIG)、血漿置換及單克隆抗體等生物制劑也為治療治療提供了可能?？傊瑧?yīng)結(jié)合發(fā)病原因及免疫學(xué)情況確定PRCA具體的治療方案。

目前針對(duì)抗EPO抗體相關(guān)純紅細(xì)胞再生障礙性貧血的精準(zhǔn)治療方案亟待進(jìn)一步研究，近年來(lái)，在低氧誘導(dǎo)EPO基因的方面合成的缺氧誘導(dǎo)因子-脯氨酰羥化酶(HIF-PH)抑制劑，可上調(diào)EPO基因的表達(dá)，用于治療慢性腎臟病以及終末期腎病(ESRD)導(dǎo)致的腎性貧血患者，臨床上可減少PRCA的發(fā)生，相比于傳統(tǒng)的紅細(xì)胞生成素刺激藥(erythro poiesis stimulating agents，ESAs)，其造價(jià)便宜，給藥途徑方便[22]，通過模擬缺氧狀態(tài)，抑制HIF羥化降解的路徑，從而達(dá)到激活HIF，誘導(dǎo)EPO合成的目的，從而糾正貧血[23]。另外促紅細(xì)胞生成素?cái)M肽(erythropoietin mimetic petide,EMP)中的代表藥物Peginesatide因其氨基酸序列與天然Epo氨基酸序列不存在同源性[24]，因此降低了引起PRCA的風(fēng)險(xiǎn)，可應(yīng)用于抗EPO抗體相關(guān)純紅細(xì)胞再生障礙性貧血患者的治療[25]。

綜上所述，抗EPO抗體相關(guān)PRCA呈逐年上升趨勢(shì)，臨床應(yīng)引起警惕。對(duì)于EPO持續(xù)治療無(wú)效，出現(xiàn)血紅蛋白及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)絕對(duì)值進(jìn)行性下降，而粒系和巨核系細(xì)胞數(shù)正常的患者應(yīng)考慮PRCA可能，盡快完善骨髓穿刺及抗EPO抗體檢查，一旦確診應(yīng)立即停用 EPO，治療上需結(jié)合患者的原發(fā)病、療效及藥物耐受情況采用個(gè)體化治療方案，若治療無(wú)效，可行腎移植治療。隨著EPO基因精準(zhǔn)治療的發(fā)展，更多安全有效的藥物將會(huì)被應(yīng)用于臨床，以使得更多的PRCA患者受益。