乙型肝炎病毒x蛋白致線粒體功能障礙相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展

凌利容，謝文輝，李 丹

福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，福建 福州 350001

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全球約有4億HBV慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌[1]。我國為HBV感染高流行區(qū)，2006-2010年全國病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國人群HBV感染率為57.6%，HBV攜帶率為9.75%，約有6.9億人曾感染過HBV，其中1.2億人發(fā)展為慢性乙型肝炎患者，每年約有35萬人死于HBV感染導(dǎo)致的肝硬化和肝癌[2]。由此可見，HBV感染已對(duì)人類尤其是我國居民的健康造成巨大的威脅[2]。目前，由HBV基因組編碼的各種蛋白的具體致病機(jī)制仍是研究熱點(diǎn)，其中乙型肝炎病毒x蛋白(hepatitis B virus x，HBx)被認(rèn)為與慢性肝炎和原發(fā)性肝癌的發(fā)生關(guān)系最為密切[1]。線粒體是參與細(xì)胞內(nèi)能量代謝、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等的重要細(xì)胞器,其與氧化應(yīng)激的相互影響對(duì)多種疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要的作用[3]。既往研究[4-5]表明，HBx可下調(diào)線粒體氧化磷酸化的酶，使肝癌細(xì)胞線粒體處于敏感狀態(tài)，進(jìn)而引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高，脂質(zhì)過氧化氫的產(chǎn)量增加，且過氧化物及自由基的聚集是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素。由此，我們得知在HBx誘導(dǎo)肝癌發(fā)生、發(fā)展的過程中，線粒體功能障礙是一個(gè)至關(guān)重要的病理生理環(huán)節(jié)。本文就HBx的結(jié)構(gòu)功能及HBx致線粒體功能障礙的可能機(jī)制研究進(jìn)展作一概述。

1 HBx基因結(jié)構(gòu)和功能

HBV是一種小型的部分雙鏈環(huán)狀嗜肝DNA病毒，其基因組長約3 200 bp,含有4個(gè)重疊的開放讀碼框，分別稱為S、C、P和x區(qū)。 x區(qū)基因是HBV基因組最小的開放讀碼框，位于13 740～1 838核酸處，全長465 bp。同時(shí)，x基因是HBV基因組結(jié)構(gòu)和功能重疊最明顯的開放讀碼框。它包含增強(qiáng)子2(Enh2)、C基因啟動(dòng)子(cp)和直接重復(fù)序列DR1、DR2，具有調(diào)控S基因和C基因活性的作用[6]。HBx具有廣泛的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，能與宿主細(xì)胞的多種蛋白相互作用，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞蛋白的功能，進(jìn)一步影響宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞癌變等。HBx可以影響轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)、TATA結(jié)合蛋白(TATA-binding protein, TBP)、cAMP反應(yīng)元素結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)，可以間接激活轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)及Pyk2和Src激酶、Ras、Raf，MAPK與信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)等信號(hào)分子，HBx還可以激活多種啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，如損傷DNA結(jié)合蛋白1(DNA damage-binding protein 1，DDB1)、早期生長應(yīng)答元件(Egr)等參與HBV的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[6]。

2 HBx在線粒體上的定位

2.1HBx大部分定位于線粒體外膜HENKLER等[7]報(bào)道HBx在胞核和胞漿均有分布，并與其表達(dá)水平有關(guān)，x蛋白在低表達(dá)的細(xì)胞中完全或絕大部分定位于細(xì)胞核內(nèi)，而過量表達(dá)時(shí)則可分布于胞質(zhì)中。HBx功能復(fù)雜多樣，在細(xì)胞核內(nèi)能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，而在胞漿內(nèi)，能夠促進(jìn)HBV病毒的復(fù)制，引起線粒體損傷。近年來眾多學(xué)者通過免疫熒光顯微鏡和亞細(xì)胞分離技術(shù)證實(shí)HBx可定位于線粒體[8-10]。TAKADA等[8]在表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，HBx可定位于線粒體，同時(shí)RAHMANI等[9]進(jìn)一步研究表明，HBx在胞質(zhì)中的水平明顯高于胞核，且主要分布于線粒體外膜上。此外，CLIPPINGER等[10]在以原代小鼠肝細(xì)胞為模型中發(fā)現(xiàn)，HBx全部插入到線粒體外膜中，而在HepG2細(xì)胞中，HBx部分暴露在線粒體的表面，部分插入到線粒體外膜中。以上這些研究均證實(shí)了HBx大部分定位于線粒體外膜。

2.2HBx氨基酸序列中與線粒體定位有關(guān)的區(qū)域HBx蛋白的氨基酸殘基數(shù)在145～154，分子量約為17 kDa。其中52～148位的氨基酸是HBx蛋白活性必須的部位，缺失第1～50位氨基酸可以上調(diào)它的轉(zhuǎn)錄功能。已有的研究[11]發(fā)現(xiàn)，HBx中有一段跨膜區(qū)域aa54～70與線粒體定位有關(guān)且其螺旋區(qū)域的aa75～88和aa109～131有助于HBx定位于線粒體。LI等[12]報(bào)道，HBx氨基酸序列的C末端是它特異性結(jié)合于線粒體的重要區(qū)域，該區(qū)域由7個(gè)氨基酸組成，其中第115位半胱氨酸殘基是HBx與線粒體作用的關(guān)鍵氨基酸，當(dāng)它突變?yōu)楸彼釙r(shí)，HBx就無法定位于線粒體。

3 HBx致線粒體功能障礙的可能機(jī)制

線粒體是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞能量代謝及信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要細(xì)胞器。在慢性肝炎及肝硬化的發(fā)展過程中，線粒體功能障礙是誘發(fā)嚴(yán)重肝病的重要環(huán)節(jié)。目前HBx致線粒體功能障礙的具體機(jī)制還未明確。大多數(shù)的研究表明，HBx可通過多種途徑打破線粒體的動(dòng)態(tài)平衡，誘發(fā)肝細(xì)胞線粒體功能損傷，主要包括以下3種：(1)HBx可與線粒體相關(guān)蛋白相互作用[13-17]；(2)HBx改變Raf-1絲蘇氨基酸激酶1(Raf serine/ threonine kinases 1,Raf-1)在細(xì)胞內(nèi)的分布[18]；(3)HBx調(diào)控Bcl-2家族蛋白參與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑[19]。

3.1HBx與細(xì)胞色素c氧化酶Ⅲ(cyto-chromecoxidaseⅢ，COXⅢ) 細(xì)胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase，COX)是線粒體呼吸電子傳遞鏈的終端酶，其主要功能是參與線粒體膜兩側(cè)的質(zhì)子傳遞。COXⅢ是組成COX質(zhì)子傳遞通路的主要組成部分，當(dāng)COXⅢ缺乏時(shí)，COX將無法進(jìn)行質(zhì)子傳遞，造成ATP合成障礙繼而導(dǎo)致電子和氧分子的累積[20]。李丹等[21-22]通過酵母雙雜交體系從成人正常肝細(xì)胞cDNA文庫中篩選出一種新的x結(jié)合蛋白COXⅢ, 并進(jìn)一步證實(shí)了具體結(jié)合區(qū)域定位于氨基酸72～117。目前已有諸多文獻(xiàn)[13,23]報(bào)道，HBx與COXⅢ的相互作用是誘發(fā)線粒體功能障礙的重要因素。ZOU等[13]通過激光共聚焦顯微在穩(wěn)定表達(dá)HBx的HL-7702細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) HBx能與COXⅢ共定位于線粒體且HBx 能夠上調(diào)COXⅢ蛋白的表達(dá)及COX的活性，導(dǎo)致質(zhì)子傳遞功能障礙，多余的質(zhì)子及電子不斷累積，進(jìn)而減少了ATP的合成，最終造成線粒體跨膜電位改變，內(nèi)源性ROS水平升高。ZHENG等[23]進(jìn)一步報(bào)道HBx可通過上調(diào)ROS水平,增加COX2的表達(dá)，進(jìn)而激活β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖。近年來關(guān)于Wnt/β-catenin通路的研究越來越多，已有研究[24]證實(shí)，活化 Wnt/β-catenin通路能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的生長。此外，過量的ROS、COX2及β-catenin與炎性疾病及癌癥的發(fā)病機(jī)制關(guān)系十分密切，特別是局部過高的ROS水平，可通過影響NF-κB、MAPKs及STAT3等信號(hào)傳導(dǎo)通路激活炎癥小體NLRP3、IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性介子的釋放，加速肝細(xì)胞的炎癥損傷[25-27]。

3.2HBx與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP) MPTP是一種存在于線粒體內(nèi)外膜之間的非特異性通道，正常生理情況下，MPTP允許分子量小于1 500的溶質(zhì)通過，當(dāng)其受到外界刺激時(shí)，MPTP開放，線粒體內(nèi)膜的完整性受到破壞，引起線粒體基質(zhì)腫脹及膜電位去極化促使細(xì)胞色素c、凋亡誘導(dǎo)因子及鈣離子等凋亡因子釋放到細(xì)胞漿中，通過啟動(dòng)半胱天冬氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死。有研究發(fā)現(xiàn)，HBx能夠通過調(diào)節(jié)線粒體MPTP的開放，使大量的鈣離子進(jìn)入胞漿，導(dǎo)致細(xì)胞漿鈣離子超載，胞漿鈣離子超載可以激活一系列蛋白激酶，活化Ras/Raf/MAPK、Pyk2/FAK-Src等信號(hào)通路，并使HBV核心蛋白COOH端磷酸化，促進(jìn)HBV DNA的復(fù)制[14-16]。隨后GAO等[28]的研究進(jìn)一步闡明，HBx可調(diào)控MPTP使得胞質(zhì)中鈣離子水平升高，并發(fā)現(xiàn)使用MPTP抑制劑環(huán)孢素A可有效降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，從而抑制HBV的復(fù)制。另外，細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道開放也會(huì)導(dǎo)致鈣超載，且當(dāng)胞漿內(nèi)的鈣離子濃度升高到一定的水平時(shí)，將會(huì)進(jìn)一步刺激MPTP開放，釋放細(xì)胞色素c及凋亡誘導(dǎo)因子等物質(zhì)，激活內(nèi)源性凋亡通路[29]。

3.3HBx與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondriaantiviralsignalingprotein，MAVS) 線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化及合成ATP的的最重要場所，除了參與細(xì)胞能量代謝外，在宿主細(xì)胞抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，這種抗病毒反應(yīng)主要依賴于線粒體外膜的一種接頭蛋白即MAVS。MAVS是線粒體中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)與先天性免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)，可通過自身的疏水跨膜結(jié)構(gòu)域( transmembrane domain, TM)定位于線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在病毒感染過程中MAVS可通過激活NF-κB和IRF3信號(hào)通路誘導(dǎo)β干擾素的生成，從而發(fā)揮抗病毒的作用。有研究[30]報(bào)道，在HBV感染過程中，HBx可以與MAVS蛋白相互作用，使MAVS的第136位賴氨酸泛素化，進(jìn)而抑制MAVS信號(hào)通路的IFN-β的生成，減弱固有免疫系統(tǒng)的抗病毒反應(yīng)。

3.4HBx與線粒體融合蛋白-2(mitofusin-2，Mfn2) 早期研究[31]發(fā)現(xiàn)HBx能夠與p53末端形成蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)復(fù)合體，通過直接或間接作用相互抑制，從而干擾p53對(duì)于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)和抑制腫瘤生長等正常功能的調(diào)控。有研究[32]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)一種新的p53結(jié)合位點(diǎn)——Mfn2，p53能夠與Mfn2的啟動(dòng)子結(jié)合，使Mfn2的表達(dá)上調(diào)。Mfn2是一種潛在的肝細(xì)胞癌腫瘤抑癌基因，有研究[33-34]表明，Mfn2有促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，且其促凋亡作用可能是通過線粒體凋亡途徑介導(dǎo)的。WANG 等[17]研究表明，在HBx轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞癌中，當(dāng)阿霉素或p53質(zhì)粒存在時(shí)，Mfn2的上調(diào)被抑制，并且在以阿霉素治療的HepG2中，Mfn2啟動(dòng)子的活性并未增強(qiáng)，這說明HBx能夠有效地干擾p53的作用位點(diǎn)，且這種干擾作用不能被某些化療藥物所恢復(fù)。以上的研究結(jié)果表明，HBx可以干擾p53對(duì)于Mfn2的直接調(diào)控，為HBx促癌機(jī)制及如何對(duì)抗以p53為作用靶點(diǎn)的化療藥物，提供了新的理論參考和依據(jù)。

3.5HBx與Raf-1Raf-1是細(xì)胞質(zhì)中一種分子量為 300～500 kDa 的多蛋白復(fù)合體，由熱休克蛋白90 及二聚蛋白 14-3-3 組成的，它能夠定位到線粒體并阻止casepase9的激活，從而保護(hù)細(xì)胞的調(diào)亡[35]。早期有研究[36]發(fā)現(xiàn)，在 HBx 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致 Raf-1 轉(zhuǎn)位到線粒體，使用免疫共沉淀法證實(shí)了HBx 與 Raf-1 形成一個(gè)蛋白-蛋白復(fù)合物。Raf-1激酶抑制蛋白(Rafkinase inhibitory protein, PKIP)，它可以與 Raf-1 結(jié)合，調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，特別是抑制 Ras-Raf-1-MEK1/2-ERK1/2 通路。在 HBx 介導(dǎo)的肝癌形成過程中，RKIP 的表達(dá)下調(diào)，使 Raf-1 的水平提高，更多的 Raf-1 換位到線粒體，增加抗凋亡的作用，從而導(dǎo)致 HBx 介導(dǎo)的HCC的形成[18]。

3.6HBx與Bcl-2家族蛋白Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，而線粒體在細(xì)胞凋亡過程中扮演重要的角色。近年來，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族蛋白可通過調(diào)控線粒體膜的通透性及刺激線粒體釋放細(xì)胞色素c等參與線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑，其家族成員在HBx蛋白誘導(dǎo)的線粒體損傷和細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用[19]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同，Bcl-2家族蛋白可分為3類：(1)含有4個(gè)BH區(qū)域的抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W和 Mcl-1等；(2)含有3個(gè)BH區(qū)域的促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bok；(3)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域(Bcl-2 homology，BH)3個(gè)亞家族，包括Bik、B1k、Bad和Bid等[37]。早期的研究[38-39]證實(shí)，HBx本身并不影響細(xì)胞色素c在細(xì)胞內(nèi)的分布及釋放，但在TNF-α的刺激下能夠顯著下調(diào)Bcl-xl的表達(dá)水平，且HBx能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性，引起Mcl-1蛋白缺失進(jìn)而激活caspase3誘發(fā)細(xì)胞凋亡。有研究[40]報(bào)道，HBx可以直接結(jié)合于Bax并促進(jìn)Bax蛋白向線粒體轉(zhuǎn)位，致線粒體膜電位丟失和細(xì)胞色素c釋放，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使用Bax的抑制劑Bcl-xl，可以抑制Bax的這一作用。此外，HBx蛋白具有BH3(Bcl-2 homology 3)樣結(jié)構(gòu)域，能與Bcl-2及Bcl-xl相互作用，弱化Bcl-2的抗凋亡作用，TERRADILLOS等[41]在HBx的轉(zhuǎn)基因小鼠中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。所以，Bcl-2家族蛋白在HBx誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中至關(guān)重要。

綜上所述，HBx是一個(gè)多功能調(diào)節(jié)蛋白，可定位于線粒體并通過多種途徑引起肝細(xì)胞線粒體的功能障礙。HBx通過與線粒體相關(guān)蛋白相互作用、改變Raf-1的分布及調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡等都將會(huì)影響線粒體的生理功能受損，引起線粒體功能障礙，導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)病理狀態(tài)，最終促成慢性肝炎及肝癌的發(fā)生、發(fā)展。HBx改變線粒體結(jié)構(gòu)功能的機(jī)制極其錯(cuò)綜復(fù)雜，仍需進(jìn)行深入研究。而對(duì)這些機(jī)制的深入研究將有助于為HBV治療提供新的藥物作用靶點(diǎn)。