蠶蛹蛋白酶解肽對糖尿病小鼠的降血糖作用

張 玉，王君虹，王 偉*，朱作藝，李 雪

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江 杭州 310021； 2.農(nóng)業(yè)部創(chuàng)意農(nóng)業(yè)重點實驗室，浙江 杭州 310021)

蠶蛹在我國資源豐富，它富含蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量達60%以上，且蠶蛹蛋白含有18種氨基酸，具有豐富的營養(yǎng)價值，已被中國衛(wèi)生部確認為一種新的食物資源[1-2]。

糖尿病是一種以代謝異常為主要特征的臨床綜合征，近年來發(fā)病率逐年增多，已成為危害人類健康的三大慢性疾病之一。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的肽段具有一定的生物活性，能夠參與調(diào)節(jié)機體新陳代謝或生理活動[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白經(jīng)不同方式酶解產(chǎn)生的酶解肽具有不同生理活性，如抗氧化活性[5]，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性[6]。我們前期通過體外活性測定研究發(fā)現(xiàn)，蠶蛹蛋白經(jīng)酸性蛋白酶酶解產(chǎn)生的多肽在體外具有抑制α-葡糖糖苷酶活性的作用[7]，但蠶蛹蛋白酶解肽進入機體，消化吸收后，是否具有降血糖活性，還需要進一步研究。

本研究以鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病小鼠模型，研究蠶蛹蛋白酶解肽對糖尿病小鼠的血糖、糖化血清蛋白(GSP)、臟器指數(shù)等方面的影響，探討蠶蛹蛋白酶解肽在機體內(nèi)的降血糖活性，從而為蠶蛹蛋白酶解肽作為功能食品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

蠶蛹蛋白粉，南通福麗爾生物制品有限公司；50 U·mg-1酸性蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司；阿卡波糖片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；0.9%氯化鈉注射液，山東齊都藥業(yè)有限公司；GSP測試盒，南京建成生物工程研究所。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

實驗動物：清潔級雄性C57小鼠，體重為(20±2)g，53只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2013-0018。

BS110S型分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司；H-1650型高速離心機，長沙湘儀離心機有限公司；UV-2102P型紫外分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；EZ-2溶劑蒸發(fā)工作站，廣州尚準儀器有限公司；MTYK-MI805 pH計，北京中慧天誠科技有限公司；HZQ-B恒溫培養(yǎng)搖床，蘇州威爾實驗用品有限公司；HH-4數(shù)顯單列四孔水浴鍋，金壇市盛藍儀器制造有限公司；DW-86L388超低溫冰箱，青島海爾集團；血糖儀，三諾安穩(wěn)免調(diào)碼型血糖儀。

1.2 方法

1.2.1 蠶蛹蛋白酶解肽的制備

稱取10.0 g的蠶蛹蛋白粉于250 mL錐形瓶中，加入150 mL的蒸餾水攪拌混勻，用1.0 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.8，加入0.2 g的酸性蛋白酶混合均勻，塞上橡膠塞子，放入搖床中以150 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4.6 h，取出，100 ℃沸水浴10 min后冷卻至室溫，用1.0 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，將樣品溶液倒入離心管中以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液在EZ-2真空濃縮蒸發(fā)工作站蒸干后，取一定量干燥物，進行后續(xù)實驗。

1.2.2 動物分組、模型建立

53只C57小鼠，其中10只設為正常對照組，43只用于建立高血糖小鼠模型，將建模小鼠按體重135 mg·kg-1腹腔注射STZ溶液，3 d后禁食5 h，取尾血測空腹血糖，高于11.1 mmol·L-1為高血糖成模小鼠。將成模小鼠取出40只，分4組，每組10只，分別為模型對照組、蠶蛹蛋白肽低劑量組、蠶蛹蛋白肽高劑量組和陽性對照組。

正常對照組和模型對照組每天灌胃0.2 mL生理鹽水；低、高劑量蠶蛹蛋白肽組分別灌胃200 mg·kg-1·d-1和800 mg·kg-1·d-1的蠶蛹蛋白酶解肽(溶于0.2 mL生理鹽水中)，陽性對照組灌胃20 mg·kg-1·d-1的阿卡波糖(溶于0.2 mL生理鹽水中)。給藥期間動物正常進食、飲水，給藥5周后，分別處死所有小鼠。

1.2.3 體重及空腹血糖檢測

每周，用分析天平稱各實驗小鼠體重1次，并剪尾取血，用血糖儀測空腹血糖。

1.2.4 GSP的測定

給藥5周后，最后一次給藥結(jié)束2 h，摘眼球取血，37 ℃水浴30 min，3 000 r·min-1離心15 min，吸取上層血清，用GSP測試盒檢測GSP的含量。

1.2.5 臟器指數(shù)的測定

給藥5周后，解剖取出小鼠的心臟、肝臟、腎臟、胸腺組織，用濾紙吸干殘血后，分別稱質(zhì)量后計算臟器指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 對小鼠基本狀況及體重的影響

表1結(jié)果顯示，糖尿病小鼠均表現(xiàn)為三多癥狀，且實驗后期小鼠體重明顯下降，嗜睡懶動，狀態(tài)不佳，活動減少。與正常對照組比，模型對照組小鼠體重在給藥0、1、2、3、4、5周顯著降低；與模型對照組比，陽性對照組及蠶蛹肽高劑量和低劑量組小鼠體重在給藥后與模型對照組無顯著差異，說明在實驗時間內(nèi)，各處理對糖尿病小鼠體重影響不大。

表1 蠶蛹蛋白肽對小鼠體重的影響

注：模型對照組與正常對照組比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 對小鼠空腹血糖的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對照組比，模型對照組小鼠空腹血糖在給藥0、1、2、3、4、5周均極顯著升高，且血糖值較為穩(wěn)定；與模型對照組比，陽性對照組小鼠空腹血糖在給藥3、4和5周顯著降低，說明實驗正常。

表2 蠶蛹蛋白肽對小鼠空腹血糖含量的影響

注：模型對照組與正常對照組比，**P<0.01；藥物處理組與模型對照組比，#P<0.05，##P<0.01。

蠶蛹蛋白肽各劑量組給藥2周后，各組小鼠血糖值與模型對照組小鼠相比有減少趨勢，在給藥3、4、5周時，各劑量組小鼠的血糖含量與模型對照組相比顯著降低。給藥5周時，蠶蛹蛋白肽低劑量組和高劑量組血糖抑制率分別為22.2%和34.2%，以上結(jié)果說明蠶蛹蛋白肽對STZ 誘導的糖尿病小鼠具有一定的降血糖作用。

2.3 對小鼠GSP的影響

圖1結(jié)果表明，模型對照組中GSP含量顯著高于正常對照組中GSP含量。與模型對照組相比，陽性對照組、蠶蛹蛋白肽高劑量組、蠶蛹蛋白肽低劑量組中GSP含量均呈下降趨勢，其中陽性對照組和蠶蛹肽高劑量組中GSP含量與模型對照組相比差異顯著。

無相同小寫字母的組間差異顯著(P<0.05)圖1 蠶蛹蛋白肽對小鼠糖化血清蛋白(GSP)含量的影響

2.4 對小鼠臟器指數(shù)的影響

由表3可知，與正常對照組比，模型對照組小鼠心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、肝臟指數(shù)均顯著升高，胸腺指數(shù)極顯著降低，說明糖尿病各小鼠臟器產(chǎn)生一定病變。與模型對照組比，陽性對照組以及蠶蛹蛋白肽各劑量組小鼠的心臟指數(shù)均顯著降低，陽性對照組小鼠的腎臟指數(shù)和肝臟指數(shù)也顯著降低，蠶蛹蛋白肽各劑量組小鼠的腎臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均有降低趨勢，其中低劑量組小鼠與模型對照組相比差異顯著，說明低劑量蠶蛹蛋白肽對小鼠心臟、肝臟和腎臟具有一定保護作用。

表3 蠶蛹蛋白肽對小鼠臟器指數(shù)的影響

注：模型對照組與正常對照組比，*P<0.05，**P<0.01；藥物處理組與模型對照組比，#P<0.05，##P<0.01。

3 小結(jié)

糖尿病是一種代謝失衡疾病，其特點為高血糖，GSP是血液中葡萄糖與白蛋白及其蛋白質(zhì)分子N末端的氨基上發(fā)生非酶促糖化反應形成的具有酮胺鍵的糖化蛋白，能反映機體過去2～3周內(nèi)平均血糖水平[8-9]。本研究結(jié)果表明，STZ致糖尿病小鼠空腹血糖顯著增加，GSP含量明顯增高，臟器指數(shù)也有顯著性改變。服用蠶蛹蛋白酶解肽3～5周，糖尿病小鼠的空腹血糖顯著降低，GSP的含量也明顯下降，心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均有一定改善。因此蠶蛹蛋白酶解肽對STZ致糖尿病小鼠具有一定的降血糖治療作用。

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