Chelex—100法和硅珠法在玻璃指紋DNA檢驗(yàn)中的比較研究

雒彩虹+亓兵+于浩

摘 要：目的：探討chelex-100法與硅珠法兩種提取方法在玻璃指紋DNA檢驗(yàn)中的比較應(yīng)用。方法：15名志愿者分別在載玻片和模擬現(xiàn)場(chǎng)窗玻璃上的指紋采樣，兩組采樣均分別用Chelex-100法與硅珠法提取，進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增和基因分型分析。結(jié)果：在載玻片上的指紋，Chelex-100法檢出率要高于硅珠法的檢出率。在模擬現(xiàn)場(chǎng)玻璃上的指紋，兩種方法的檢出率都相對(duì)較低，但是硅珠法要稍高于chelex-100法。結(jié)論：針對(duì)相對(duì)較干凈的汗?jié)撝讣y建議采用chelex-100方法進(jìn)行提取擴(kuò)增，避免硅珠法在提取過(guò)程中的損失；遇到檢材較差的汗?jié)撝讣y應(yīng)用硅珠法效果會(huì)好于chelex-100法，并且建議進(jìn)行多次平行擴(kuò)增。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)物證學(xué)；提取方法；STR分型；汗?jié)撝讣y

中圖分類(lèi)號(hào)：D919 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-4379-（2017）32-0049-03

作者簡(jiǎn)介：雒彩虹（1983-），女，碩士研究生，江蘇警官學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系，助教，研究方向：法醫(yī)物證。

Abstract：Objective ：To compare the two extraction methods of Chelex-100 and silicon beads in DNA examination of glass fingerprints.Methods：The fingerprints of 15 volunteers were sampled on slides and simulated window glass，and two groups of samples were extracted by Chelex-100 and silica beads，respectively.STR amplification and genotyping were performed.Results：In the slide fingerprints，the detection rate of Chelex-100 was higher than that of silica beads.in the glass fingerprints of the simulation field，the detection rate of the two methods is relatively low，but the silicon beads should be slightly higher than the Chelex-100 method.Conclusion：For the relatively clean sweat latent fingerprints，Chelex-100 method is suggested to extract and amplify，avoiding the loss of silicon beads in the extraction process；When the sweat fingerprints are poor，the bead method is better than the Chelex-100 method，and multiple parallel amplification is recommended.

Key words：Forensic biological evidence；Extraction method；STR typing；Sweat latent fingerprints

在實(shí)際案件中現(xiàn)場(chǎng)遺留的檢材多數(shù)是痕量DNA檢材，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增時(shí)只擁有低拷貝DNA模板[1]，而現(xiàn)階段玻璃上汗?jié)撝讣yDNA模板是公安實(shí)際工作中比較常見(jiàn)的。汗?jié)撝讣y指的是含有手指脊線(xiàn)分泌的脊線(xiàn)汗或粘有臉部皮膚皮脂汗的手指末端與客體接觸后，留下肉眼不能直接看見(jiàn)的指紋印跡[2]。汗?jié)撝讣y是在犯罪現(xiàn)場(chǎng)中比較常見(jiàn)的痕跡檢驗(yàn)的物證，也是痕跡檢驗(yàn)的重要檢測(cè)和研究對(duì)象。汗?jié)撝讣y中存在有比較微量的脫落細(xì)胞[2]。現(xiàn)如今隨著DNA檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了DNA檢測(cè)的微量化，讓我們對(duì)汗?jié)撝讣yDNA的檢測(cè)成為了可能。但是在基層相關(guān)汗?jié)撝讣y的DAN檢驗(yàn)中，由于實(shí)際案件中遇到的指紋情況比較復(fù)雜，前期高效高質(zhì)量的提取過(guò)程對(duì)于后期等位基因的檢出率起到了至關(guān)重要的作用，在實(shí)踐過(guò)程中，只有找到最合適有效的方法，才能為后續(xù)的檢驗(yàn)工作打下扎實(shí)的基礎(chǔ)。本文通過(guò)對(duì)模擬玻璃上汗?jié)撝讣yDNA的檢驗(yàn)，初步探討實(shí)際案例中遇到相似檢材時(shí)的首選檢驗(yàn)方法，為實(shí)際案例檢驗(yàn)提供指導(dǎo)方案。具體將進(jìn)行兩種現(xiàn)場(chǎng)的模擬，一種為載玻片上汗?jié)撝讣y的模擬，另外一種為實(shí)驗(yàn)室窗戶(hù)外側(cè)玻璃上的汗?jié)撝讣y的模擬，然后分別采用Chelex-100法和硅珠法分別對(duì)模擬的汗?jié)撝讣y進(jìn)行提取、擴(kuò)增、檢測(cè)，分析統(tǒng)計(jì)兩種不同提取方法，對(duì)等位基因檢出率情況進(jìn)行總結(jié)，進(jìn)而達(dá)到比較優(yōu)劣的情況。

一、材料與方法

（一）樣本

15名志愿者分別雙手食指、中指、無(wú)名指以約1.5kg的力度按壓在載玻片上，時(shí)間大約5s，24小時(shí)后同一時(shí)間同樣的方法按壓在實(shí)驗(yàn)室窗戶(hù)外側(cè)玻璃上。按壓在載玻片上的統(tǒng)一歸為A組，按壓在實(shí)驗(yàn)室窗戶(hù)外側(cè)玻璃上的統(tǒng)一歸為B組。A組中所有15名志愿者左手共45枚指紋分別標(biāo)為A1、A2……A45，A組中所有15名志愿者右手共45枚指紋標(biāo)為A1-2、A2-2……A45-2。B組中所有15名志愿者左手共45枚指紋分別標(biāo)為B1、B2……B45，B組中所有15名志愿者右手共45枚指紋分別標(biāo)為B1-2、B2-2……B45-2。

（二）提取方法

A組中45枚指紋A1、A2……A45和B組中45枚指紋B1、B2……B45分別用Chelex-100方法提取[3]，A組中45枚指紋A1-2、A2-2……A45-2和B組中45枚指紋B1-2、B2-2……B45-2分別按照硅珠法進(jìn)行提取[4-5]。其中Chelex-100法中用20μl體系，硅珠法中用20μl進(jìn)行洗脫。均快速離心后進(jìn)行擴(kuò)增。endprint

（三）擴(kuò)增體系

本實(shí)驗(yàn)采用的是美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的AmpFlSTR Identifiler Plus試劑盒（即ID Plus），ID Plus試劑盒所采用的是ABI公司（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）的五色熒光技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)16個(gè)STR位點(diǎn)同時(shí)擴(kuò)增、檢測(cè)。ID Plus試劑盒包括全部16個(gè)位點(diǎn)PCR擴(kuò)增所需要的引物（Primer set），Taq酶，PCR擴(kuò)增試劑（Mix）以及陽(yáng)性對(duì)照9947A。

本實(shí)驗(yàn)采用的擴(kuò)增體系（見(jiàn)表1）。

因?yàn)镈NA模板量較少，我們其他條件不變，將循環(huán)次數(shù)改為30次[6]，具體步驟為95°C熱啟動(dòng)11min，94°C變性20s，59°C退火和延伸3min，變性、退火、延伸循環(huán)30次，60°C延伸10min，最后4°C恒溫保存。

（四）等位基因檢測(cè)

利用移液器吸取1.5μl的擴(kuò)增液至另一個(gè)96孔板中，再按照一定的比例加入Liz500和HIDI溶液，并設(shè)置兩個(gè)Ladder，最后放入3500XL基因分析儀中進(jìn)行分析，利用Genemapper ID-X軟件測(cè)定樣品片段大小與同一凝膠或一批加樣的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物（Ladder）比對(duì)，進(jìn)行基因分型。

二、結(jié)果

根據(jù)AmpFlSTR Identifiler Plus試劑盒用戶(hù)手冊(cè)中推薦的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為28次循環(huán)，推薦體系為25μl體系，可有效檢出的最低模板量為0.05ng，即模板DNA量大于等于0.05ng時(shí)，DNA檢測(cè)結(jié)果能夠明確判讀；而當(dāng)模板DNA量低于0.05ng時(shí)，檢測(cè)結(jié)果則無(wú)法正確判讀。本文中采用國(guó)內(nèi)通用的擴(kuò)增體系10ul進(jìn)行擴(kuò)增，并增加2個(gè)循環(huán)數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。然后利用3500XL進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用純合子大于150熒光單位，雜合子大于75個(gè)熒光單位進(jìn)行判讀，低于此標(biāo)準(zhǔn)不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

（一）擴(kuò)增體系對(duì)汗?jié)撝讣yDNA影響

汗?jié)撝讣yDNA屬于微量檢材，其含有較低濃度的DNA分子，故我們將其循環(huán)數(shù)增加2個(gè)，以增加DNA的檢出率，增加2個(gè)循環(huán)數(shù)對(duì)DNA的非特異擴(kuò)增及不平衡擴(kuò)增影響不大，但可以有效增加DNA濃度。

（二）2種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

由表2可知，在載玻片上的模擬汗?jié)撝讣y，Chelex-100法檢出率要高于硅珠法的檢出率，分析其原因chelex-100法對(duì)檢材沒(méi)有損耗，而硅珠法步驟相對(duì)繁瑣，再加上DNA分子量少時(shí)，硅珠結(jié)合率也不高，致使此結(jié)果的出現(xiàn)。因此我們認(rèn)為在公安實(shí)際工作中遇到案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)遺留在玻璃制品上的相對(duì)干凈的殘缺汗?jié)撝讣y采用Chelex-100法效果要相對(duì)較好。

在模擬實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)玻璃外側(cè)指紋的檢測(cè)時(shí)，兩種方法的檢出率都相對(duì)較低，但是總的來(lái)講硅珠法要稍高于chelex-100法，分析原因可能為現(xiàn)場(chǎng)檢材中有較多的灰塵等雜質(zhì)，硅珠法能有效的去除這些抑制物，而chelex-100法雖沒(méi)有損耗，但是對(duì)于這些抑制物確無(wú)法進(jìn)行去除，直接影響了DNA的擴(kuò)增效率，影響到了檢測(cè)結(jié)果。對(duì)實(shí)際情況中遇到檢材較差的汗?jié)撝讣y應(yīng)用硅珠法效果會(huì)好于chelex-100法，并且建議進(jìn)行多次平行擴(kuò)增，可以得到部分完整的DNA分型。

三、討論

本實(shí)驗(yàn)中采用了兩種提取方法，并且分別對(duì)兩種不同的模擬汗?jié)撝讣y進(jìn)行了提取與檢測(cè)。汗?jié)撝讣y中的DNA含量不同的人相差很大，這和個(gè)體因素有很大關(guān)系，本試驗(yàn)中有的個(gè)體無(wú)論是模擬載玻片上的汗?jié)撝讣y還是模擬實(shí)驗(yàn)室窗戶(hù)外側(cè)玻璃上的汗?jié)撝讣y，DNA檢出率都相對(duì)較高，而有一名志愿者無(wú)論哪種方式，均未獲得等位基因。這種個(gè)體之間的差異和本人的代謝水平有直接聯(lián)系，對(duì)于代謝旺盛，出汗較多的個(gè)體相對(duì)檢出率要高，而對(duì)于那些代謝水平較低的檢出率也低。在實(shí)際公安工作中，好多盜竊嫌疑人的心理素質(zhì)也很重要，對(duì)于那些慣犯，心理素質(zhì)強(qiáng)的，檢出率同樣較低，而那些心理素質(zhì)差，新手，盜竊財(cái)物時(shí)比較緊張的檢出率也較高。本實(shí)驗(yàn)未考慮個(gè)體之間的差異以及其心理素質(zhì)等方面的問(wèn)題，如有可能，可以對(duì)這幾方面進(jìn)行深入研究。不過(guò)通過(guò)對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，筆者認(rèn)為以后對(duì)這種微量的汗?jié)撝讣yDNA可以進(jìn)行多次平行擴(kuò)增，以期待能得到好的結(jié)果。

在實(shí)際公安工作中，較干凈的汗?jié)撝讣y碰到的比較少，筆者在實(shí)際工作中提取到的較干凈的指紋一般是嫌疑人翻動(dòng)受害人家中玻璃制品時(shí)留下的殘缺指紋，對(duì)這類(lèi)相對(duì)較干凈的汗?jié)撝讣y建議采用chelex-100方法進(jìn)行提取擴(kuò)增，避免硅珠法在提取過(guò)程中的損失，得出完整分型的可能性要大于硅珠法。而對(duì)于受害人室外玻璃上較臟的殘缺指紋建議采用硅珠法進(jìn)行提取，因?yàn)檫@類(lèi)檢材中含有較多的雜質(zhì)，會(huì)影響擴(kuò)增效率，硅珠法的最大優(yōu)點(diǎn)就是可以有效的除去這類(lèi)雜質(zhì)，減少對(duì)擴(kuò)增效率的影響。針對(duì)汗?jié)撝讣y這種微量檢材進(jìn)行相應(yīng)的平行擴(kuò)增，對(duì)增加得到完整DNA圖譜的概率有很大幫助。

[ 參 考 文 獻(xiàn) ]

[1]GILL P.Application of low copy number DNA profiling[J].Croatian Medical Journal，2001，42（3）：229-232.

[2]王桂強(qiáng).指印的光學(xué)顯現(xiàn)和照相技術(shù)[M].北京：群眾出版社，2001.25.

[3]WalshBS，MetzgerDA，HiguchiR.Chelex-100 asmedium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material[J].Biotechnics，1991，10（6）：506-513.

[4]Stacy FR，Jakonbsen.Reliable nonivnasive genotyping based on excremental PCR of nuclear DNA purified with a magnetic bead protocol[M].Molecular Ecology，1999，8（5）：879.

[5]鄭秀芳，凌鳳俊，涂政，等.模板DNA磁珠提取法[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2003，18（2）：107.

[6]GillP，WhitakerJ，F(xiàn)laxmanC，etal.An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100pg of DNA[J].Forensic Science International，2000，112（1）：17-40.endprint