精芪雙參膠囊質(zhì)量控制方法的改進(jìn)

吳 萍，高 嵩*，徐 建，鄭廣晶，李亞東，崔憲利

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司 吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130103；2.吉林長白山藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，吉林 白山 134300）

精芪雙參膠囊由人參、黃芪、丹參、黃精4味中藥組成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、活血化瘀、養(yǎng)心安神等功效?，F(xiàn)執(zhí)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-5136（B-0136）-2014Z[1]。標(biāo)準(zhǔn)中收載丹參酮IIA、人參薄層色譜鑒別項(xiàng)及黃芪甲苷含量測定項(xiàng)，人參薄層鑒別方法重現(xiàn)性差，缺少君藥丹參含量測定指標(biāo)。故本文對人參薄層鑒別方法進(jìn)行了改進(jìn)，并建立方中君藥丹參的高效液相含量測定方法，從而更加全面、準(zhǔn)確的控制產(chǎn)品質(zhì)量[2-3]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimae-3000雙三元梯度液相色譜（美國戴安公司）、SLD-1型薄層色譜攝影儀（天津思利達(dá)色譜技術(shù)開發(fā)公司）、AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多公司）、KQ-300DE超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑、試藥 樣品來源：吉林長白山藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；對照品來源：人參皂苷Rg1（批號：110703-200424）、人參皂苷Re（批號：110754-201123）、人參皂苷Rb1（批號：110704-201424） 、人參對照藥材（批號：120917-201110）、丹酚酸B（批號111562-201514）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、磷酸為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 人參薄層色譜鑒別方法的改進(jìn)

2.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物2.5 g，加水30 mL，攪拌均勻，超聲處理20 min，離心，取上清液，用三氯甲烷提取2次（輕搖），20 mL/次，棄去三氯甲烷液，水層以水飽和的正丁醇提取2次，30 mL/次，合并正丁醇液，再以正丁醇飽和的氨試液洗2次，60 mL/次，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2 陰性樣品溶液制備 按精芪雙參膠囊工藝和處方比例，制備缺人參的陰性樣品，按2.1項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 對照藥材溶液制備 取人參對照藥材0.5 g，按2.1項(xiàng)下方法制成對照藥材溶液。

2.4 對照品溶液制備 取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb1對照品，分別加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.5 展開及顯色條件

2.5.1 原方法 吸取上述4種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13 : 7 : 2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，置冰箱冷藏層展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，但人參皂苷Rg1與黃芪甲苷色譜斑點(diǎn)分離效果較差[4-7]。

2.5.2 改進(jìn)的方法 吸取上述4種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水（10 : 4 : 5 : 2 : 2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在90 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，各斑點(diǎn)分離效果較好，方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好[8-9]。

2.6 耐用性試驗(yàn) 取1批樣品進(jìn)行耐用性試驗(yàn)。其中包括：1）不同廠家薄層板的考察；2）溫度考察；3）濕度考察；4）點(diǎn)樣方式考察。具體試驗(yàn)條件見表1。結(jié)果：人參薄層鑒別方法耐用性較好。

表1 薄層鑒別耐用性試驗(yàn)條件

3 丹酚酸B含量測定

3.1 色譜條件 建立色譜柱為Hypecsil ODS C18柱（4. 6 mm ×250 mm，5 μm）；以甲醇-0.2%磷酸溶液（40 : 60）為流動相；檢測波長為286 nm；理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

3.2 對照品溶液制備 取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含0.10 mg的溶液，即得。3.3 供試品溶液制備 取裝量差異項(xiàng)下本品內(nèi)容物，混勻，取約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加70%甲醇約20 mL，密塞，超聲處理（功率400 W，頻率為50 kHz）20 min，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 線性關(guān)系的考察 取丹酚酸B對照品溶液（0.10 mg/mL），分別精密吸取2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，繪制丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果：回歸方程為Y = 1.987 7X-2.448，相關(guān)系數(shù)r值為1，說明丹酚酸B在0.2～2.0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系[10-11]。

3.5 專屬性試驗(yàn) 按精芪雙參膠囊工藝和處方比例，制備缺丹參的陰性樣品，同法測定丹酚酸B對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品的HPLC色譜圖。結(jié)果：在與對照品色譜相應(yīng)位置上，供試品溶液與其他組分分離度良好，陰性對照無干擾。

3.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一丹酚酸B對照品溶液10 μL，連續(xù)注入液相色譜儀6次, 按上述色譜條件測定峰面積。結(jié)果：丹酚酸B相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為0.18% ，表明儀器精密度較好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、4、8、12、24 h測定1次，記錄丹酚酸B峰面積，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果：丹酚酸B峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.66%，表明供試品溶液中丹酚酸B在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品內(nèi)容物適量，取約0.1 g，精密稱定，共6份，按上述色譜條件測定其含量。結(jié)果：樣品中丹酚酸B平均含量為2.11 mg/粒，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.88 %，表明方法重復(fù)性較好。

3.9 回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品（丹酚酸B含量2.11 mg/g），取約 0.05 g，6份，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，精密量取丹酚酸B對照品溶液（0.105 5 mg/mL） 1 mL，6份，分別加入上述容量瓶中，按供試品溶液制備方法操作，制得回收率試驗(yàn)供試品溶液。按正文含量測定項(xiàng)下方法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果：平均回收率為99.60%，RSD為0.56%。表明本方法準(zhǔn)確度良好。

3.10 耐用性試驗(yàn) 分別考察流動相流速的變化、流動相比例的變化以及采用不同品牌的色譜柱對同一批樣品含量測定結(jié)果的影響。結(jié)果：在上述條件下測得同一批樣品中丹酚酸B含量RSD值＜2%。色譜條件在一定范圍內(nèi)變化對試驗(yàn)結(jié)果影響較小，表明方法耐用性良好。

3.11 10批樣品含量測定 按建立含量測定方法分別測定不同批次精芪雙參膠囊中丹酚酸B含量，結(jié)果：10批樣品每粒含丹參以丹酚酸B計(jì)均在1.7 mg以上，根據(jù)10批樣品的測定結(jié)果，按平均含量80%計(jì)，制定含量限度范圍為本品每粒含丹參以丹酚酸B（C36H30O16）計(jì)，不得少于1.5 mg。

4 討論

由于精芪雙參膠囊中人參所含成分復(fù)雜且與黃芪所含成分極性相近，薄層鑒別方法所用展開系統(tǒng)也基本相同，普通硅膠G板無法將兩者分離。而選擇高效硅膠G板時(shí)，各成分間分離效果較好。

分別采用1）三氯甲烷-甲醇-水（13 : 7 : 2）10 ℃以下放置的下層溶液；2）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15 : 40 : 22 : 10）10 ℃以下放置的下層溶液；3）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水（5 : 2 : 3 :1 : 1）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果：以展開劑2）和3）進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，均能將人參皂苷Rg1與干擾成分分離，展開劑3）分離效果最佳。

精芪雙參膠囊方中君藥丹參的水溶性酚酸類成份具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、養(yǎng)心安神的功效，其代表成分為丹酚酸B，故本文建立丹酚酸B含量測定方法，更全面的監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量。丹酚酸B在檢測過程中易發(fā)生分解，因此分別重點(diǎn)考察不同柱溫及不同濃度磷酸溶液為流動相對丹酚酸B含量的影響，結(jié)果柱溫在25 ℃以上丹酚酸B的含量隨溫度升高逐漸降低，且分離效果也逐漸降低；流動相體系中磷酸溶液濃度為0.1%（pH = 2.5）時(shí)樣品含量及峰對稱度均為最佳[12-16]。

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