益腎補骨液高效液相色譜法特征圖譜研究

徐 云，王婷婷，肖俊美，王寶成 ，徐 建*

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司 吉林省中藥標準化關鍵工程技術重點實驗室，長春 130103；2. 通藥制藥集團股份有限公司，吉林 通化 134000）

益腎補骨液由骨碎補、何首烏、茯苓、續(xù)斷、白芍、當歸等12味中藥制成。具有滋補肝腎，強壯筋骨功效。用于肝腎不足，勞傷腰痛，筋骨損傷?，F行標準收載于部頒標準中藥成方制劑第10冊，僅有何首烏理化鑒別，何首烏、白芍薄層鑒別，無法全面表征該中藥制劑的物質基礎和化學成分群的整體性和復雜性，難以全面的控制益腎補骨液的內在質量。本實驗研究建立了益腎補骨液HPLC特征圖譜，對10批益腎補骨液進行了指紋圖譜分析。益腎補骨液與組方藥味間有較好的相關性，采用該法可幫助確定色譜峰的歸屬，進一步分析益腎補骨液的化學組成及來源，為益腎補骨液的質量控制提供理論依據[1-5]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀；戴安（雙三元）高效液相色譜儀；AB204-E型分析天平。1.2 試藥 甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，磷酸等其他試劑均為分析純；益腎補骨液（批號：160901、160902、160903、160904、160905、160906、160907、160908、160909、160910）均由通藥制藥股份有限公司提供；沒食子酸（批號：110831-200302 ）、 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號：110844-201512 ）、芍藥苷對照品（批號110736-201438）、柚皮苷對照品（批號：110722-201111 ）、綠原酸 （批號：110753-201314 ）均由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[6-9]色譜柱：ACE C18色譜柱，（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以甲醇為流動相A，以0.02%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～ 40 min，5%A → 40%A，40～ 50 min，40%A → 40%A，50～ 51 min，40%A → 5%A，51～60 min，5%A→5%A；）流速為1 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為35 ℃，進樣量：5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液制備 取沒食子酸、芍藥苷、綠原酸、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL分別含0.1 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品，精密量取15 mL，加水至30 mL。用乙醚振搖提取2次，30 mL/次，棄去乙醚液，水液用水飽和正丁醇振搖提取3次，30 mL/次，合并正丁醇液，再用正丁醇飽和水洗2次，20 mL/次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液連續(xù)進樣6次，以芍藥苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間，計算結果RSD值均小于2.0%。結果表明，該儀器測試精度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批（批號：160901）益腎補骨液6份，分別按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，記錄色譜圖，以芍藥苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間，計算結果RSD值均小于2.0%。結果表明方法的重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份益腎補骨液的供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、20 h進樣，記錄色譜圖，以芍藥苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間，計算結果RSD值均小于2.0%。結果表明供試品溶液在20 h內穩(wěn)定。

2.4 特征圖譜建立及相關性分析 取10批益腎補骨液成品，按上述選定的供試品溶液制備方法和檢測方法進行檢測。將10批益腎補骨液成品的測試數據導入國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2004A）”軟件，采用中位數法，多點校正，自動匹配，共標定13個共有峰，并鑒定歸屬了5個特征峰；對13個特征峰進行歸屬：1號（沒食子酸）、6號、8號（芍藥苷）特征峰歸屬為白芍藥材；2號、3號、4號（綠原酸）、5號、7號、10號特征峰歸屬為續(xù)斷藥材；9號（二苯乙烯苷）特征峰歸屬為何首烏藥材；11號和13號（柚皮苷）特征峰歸屬為骨碎補藥材。10批成品特征圖譜疊加圖、生成的對照圖譜分別見圖1～圖2。

圖1 10批成品特征圖譜疊加圖

圖2 成品對照特征圖譜

3 討論

采用二級陣列檢測器，對供試品檢測波長進行了考察，考察200～400 nm全波長掃描，并重點考察在230、283、320 nm波長處的色譜圖，結合DAD三維圖及基線的波動程度、色譜峰的數目、信號響應強弱，確定230 nm 為最佳波長?？疾炝肆鲃酉啵?）甲醇-水系統，線性洗脫。2）乙腈-水系統，線性洗脫。3）甲醇-磷酸水系統，非線性洗脫。流動相3）系統較好，并在此系統下進行了進一步的優(yōu)化[10-17]。益腎補骨液主要色譜峰與其組方藥味間有較好的相關性，采用該法可幫助確定藥效部色譜峰的歸屬，進一步分析益腎補骨液化學組成及來源，可為益腎補骨液的質量控制提供理論保證。

[1]楊獻玲,徐多多,高陽,等.高效液相色譜法建立黃芪多糖特征圖譜研究[J].長春中醫(yī)藥大學學報, 2016, 32(4):701-703.

[2]徐建,徐云,王鑫,等.骨骼風痛片中雞血藤高效液相特征圖譜研究[J]. 長春中醫(yī)藥大學學報, 2013, 29(5):928-930.

[3]李紅梅,佟志軍,孫麗,等.滿山紅中黃酮類成分液相色譜指紋圖譜研究[J].長春中醫(yī)藥大學學報, 2016, 32(4):708-710.

[4]魏穎,王東超,高佳琪,等.HPLC-DAD 法同時測定糖痹康中6 種主要活性成分[J].長春中醫(yī)藥大學學報, 2016,32(6):1135-1138.

[5]江潔怡,董玉娟,李養(yǎng)學,等.桂枝配方顆粒的HPLC 指紋圖譜研究[J].長春中醫(yī)藥大學學報, 2014, 30(6):1015-1018.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015:105.

[7]馮冰,陳婷. HPLC測定復方昆丹膠囊中芍藥內酯苷,芍藥苷,二苯乙烯苷,五沒食子酰葡萄糖[J].中國實驗方劑學雜質, 2012, 18(7):112-116.

[8]劉巖. HPLC法測定參蘇片中柚皮苷的含量[J].長春中醫(yī)藥大學學報, 2014, 30(3):417-427.

[9]付玉梅,張俐偉,伍振峰,等.陳皮藥材水提物的HPLC特征指紋圖譜研究[J].中成藥, 2006, 28(1):8-10.

[10]張琦,王鎮(zhèn)中,蕭偉,等.白芍藥材UPLC特征指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志, 2011, 36(6):712-714.

[11]張志海,王彩云,楊天鳴,等.陳皮的化學成分及藥理作用研究進展[J].西北藥學雜志, 2005, 20(1):47-48.

[12]彭雙,韓立峰,王濤,等.骨碎補中的化學成分及藥理作用研究進展[J].天津中醫(yī)藥大學學報, 2012, 31(2):122-125.

[13]孫桂波,紀鳳蘭.何首烏的化學成分及藥理作用研究進展[J].長春中醫(yī)藥大學學報, 2007, 23(4):105-106.

[14]彭銳,馬鵬,李龍云,等.不同產地川黨參藥材的HPLC指紋圖譜[J].中國中藥雜志, 2010, 35(2):183-186.

[15]楊來英,崔芳,吳國泰,等.當歸藥材不同提取部分的指紋圖譜分析[J].中國實驗方劑學雜志, 2014, 20(13):55-60.

[16]鄢海燕,鄒純才.瓜蔞薤白顆粒的高效液相色譜特征圖譜及與組方藥味的相關性[J].中國醫(yī)院藥學雜志, 2013,33(4):276-280.

[17]王海麗,潘薇,張國躍,等.兒童回春顆粒HPLC特征圖譜研究[J].藥物分析雜志, 2016, 36(9):1689-1695.