上中下通用痛風(fēng)湯對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型TLR4信號通路的影響

李 欣，柴晶美，楊阿龍，馬怡軒，周麗雅

（長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130117）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（GA）屬于代謝性骨關(guān)節(jié)疾病，是由于機(jī)體對嘌呤類物質(zhì)代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致的血尿酸濃度過高，尿酸鹽結(jié)晶沉積導(dǎo)致以關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)為主要表現(xiàn)的一種疾病[1-2]。上中下通用痛風(fēng)湯是由金元四大家之一朱丹溪所創(chuàng)制，出自《丹溪心法·痛風(fēng)》，上中下通用痛風(fēng)湯具有宣暢氣機(jī)、清熱化痰、活血行瘀、通絡(luò)止痛之功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)上中下通用痛風(fēng)湯具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[3-5]，可降低關(guān)節(jié)腫脹程度，降低炎癥因子表達(dá)，本研究將以TLR4/ NF-kB信號通路為切入點，分析上中下通用痛風(fēng)湯抗炎鎮(zhèn)痛機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠 60 只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，許可證號SYXK（吉）2013－0005。

1.2 藥物與試劑 上中下通用痛風(fēng)湯組方：酒炒黃柏、蒼術(shù)、天南星各60 g，桂枝、威靈仙、羌活各9 g，防己l.5 g，桃仁、白芷各15 g，龍膽草1.5 g，川芎60 g，炒神曲30 g，紅花4.5 g。按常規(guī)方法煎煮后濃縮至生藥1 g/mL， 4 ℃冰箱冷藏備用。吲哚美辛片（上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司）；尿酸鈉（美國 Sigma），SP試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司），TLR4、MYD88抗體（美國BD）。奧林帕斯光學(xué)顯微鏡BX51。

1.3 動物分組、給藥及造模 清潔級SD大鼠 60 只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，隨機(jī)均分為6 組：正常對照組，模型組，吲哚美辛組（5 mg/kg），上中下通用痛風(fēng)湯高（20 g/kg）、中（10 g/kg）、低（5 g/kg）劑量組，正常對照組和模型組灌胃等量生理鹽水，上中下通用痛風(fēng)湯組灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)7 d，末 次 給 藥1 h后，按Coderre[6]經(jīng)典方法制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型?？瞻讓φ战M左踝關(guān)節(jié)注射等體積的生理鹽水。

1.4 檢測大鼠踝周徑變化值 在受試踝關(guān)節(jié)相同部位于造模前及造模后6、12、24、48 h，用軟尺測量受試踝關(guān)節(jié)周長，觀察造模前后受試大鼠關(guān)節(jié)周長的變化。

1.5 滑膜組織形態(tài)學(xué)檢測 取各組大鼠左踝關(guān)節(jié)，多聚甲醛溶液固定 24 h，脫鈣 1 周；脫鈣后進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋，經(jīng)髁突矢狀面以5 μm厚度低溫連續(xù)切片，蘇木精-伊紅 （HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察上中下通用痛風(fēng)湯對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)病理組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 滑膜組織TLR4、NF-κB檢測 采用SP免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜TLR、NF-κB蛋白表達(dá)情況。實驗步驟按照說明書要求進(jìn)行，染色結(jié)果為褐色的表示TLR4、MYD88陽性表達(dá)。 采用平均吸光度值反映TLR4、NF-κB陽性表達(dá)的強(qiáng)度，每例標(biāo)本的被檢區(qū)測 3張切片，采用 Image-Pro Plus 6.0 形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件 SPSS 19.0進(jìn)行分析， 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示， 兩組間比較進(jìn)行t 檢驗，多組均數(shù)間比較采用方差分析， 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 上中下通用痛風(fēng)湯對尿酸鈉致大鼠踝周徑的影響 與空白對照組比較，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型組大鼠造模后6、12、24、48 h不同時間點大鼠踝周徑均顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較， 上中下通用痛風(fēng)湯高劑量組大鼠在造模后隨著時間延長大鼠踝周徑均顯著降低（P＜0.05）；上中下通用痛風(fēng)湯中劑量組及吲哚美辛組大鼠在造模后大鼠踝周徑也顯著降低（P＜0.05），踝周徑的動態(tài)變化見表1。中藥中劑量組和吲哚美辛組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，吲哚美辛組與中藥高劑量組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果提示上中下通用痛風(fēng)湯和吲哚美辛均能緩解大鼠關(guān)節(jié)腫脹，中藥高劑量組優(yōu)于吲哚美辛組。

表1 上中下通用痛風(fēng)湯對大鼠踝周徑的影響（，n = 10）

表1 上中下通用痛風(fēng)湯對大鼠踝周徑的影響（，n = 10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△ P＜0.05；與吲哚美辛組比較，▲ P＜0.05

組 別踝周徑變化6 h 12 h 24 h 48 h對照組 1.267±0.065 1.146±0.053 1.133±0.060 1.137±0.030模型組 1.739±0.369# 1.598±0.225# 1.475±0.390# 1.393±0.175#吲哚美辛組 1.545±0.136△ 1.497±0.128△ 1.407±0.146 1.206±0.180高劑量組 1.464±0.205△▲ 1.390±0.101△▲ 1.243±0.130△▲ 1.163±0.120△▲中劑量組 1.510±0.230△ 1.460±0.140△ 1.355±0.240△ 1.220±0.220△低劑量組 1.564±0.180△ 1.479±0.320△ 1.380±0.140△ 1.260±0.130△

2.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理觀察 空白對照組 大鼠關(guān)節(jié)表面被覆透明軟骨，關(guān)節(jié)囊腔光滑，結(jié)構(gòu)層次清晰，未見滑膜腫脹、炎細(xì)胞浸潤。模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜可見中度充血水腫、腫脹，伴有大量炎細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞變性壞死，輕度增生。上中下通用痛風(fēng)湯組可見關(guān)節(jié)滑膜較平整、輕度充血水腫。病理觀察顯示上中下通用痛風(fēng)湯具有改善踝關(guān)節(jié)炎細(xì)胞浸潤、滑膜組織破壞、血管擴(kuò)張及充血功能。

2.3 上中下通用痛風(fēng)湯對大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB表達(dá)的影響 結(jié)果顯示對照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4與NF-κB染色陽性區(qū)域較少，提示上中下通用痛風(fēng)湯可降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜TLR4與NF-κB蛋白表達(dá)。見表2。

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中TLR4、NF-κB表達(dá)的IOD/area值比較（，n = 10）

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中TLR4、NF-κB表達(dá)的IOD/area值比較（，n = 10）

注：與對照組比較，# P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05

組 別 TLR4 NF-κB對照組 0.235±0.004 0.31±0.035模型組 0.35±0.030# 0.45±0.120#吲哚美辛組 0.265±0.020△ 0.37±0.110△高劑量組 0.245±0.016△ 0.295±0.075△中劑量組 0.253±0.006△ 0.368±0.085△低劑量組 0.073±0.023△ 0.394±0.053△

3 討論

痛風(fēng)是屬于機(jī)體嘌呤代謝紊亂所致的一類代謝性疾病，由于尿酸鈉結(jié)晶在關(guān)節(jié)周圍組織沉積而引起的急性炎癥反應(yīng)，其中炎癥因子如IL-6、IL-1 、TNF-α、IL-8等參與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[7]。TLR4可識別作為機(jī)體內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式的尿酸鈉，啟動其下游信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子合成并釋放。有研究[8-13]發(fā)現(xiàn)，TLR4缺陷的小鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度明顯減輕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)上中下通用痛風(fēng)湯具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，可降低 IL-1、TNF、IL-6 等多種炎癥因子的表達(dá)水平，對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有較好的治療效果。本研究以TLRs/NF-κB信號通路為切入點探討上中下通用痛風(fēng)湯抗炎鎮(zhèn)痛作用，揭示其作用機(jī)制。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，TLR4與NF-κB表達(dá)升高，伴有大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度明顯升高，而經(jīng)上中下通用痛風(fēng)湯治療后，結(jié)果顯示，TLR4與NF-κB表達(dá)下降，并伴有大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度的降低，關(guān)節(jié)炎癥顯著改善，提示尿酸鈉晶體可能通過被TLR4識別，并啟動TLR4/NF-κB信號通路，進(jìn)而加重急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織的炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果提示，TLR4/NF-κB信號通路在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，上中下通用痛風(fēng)湯可通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮治療作用，但其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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