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    利用分子信標(biāo)和EXO III放大熒光信號(hào)快速檢測(cè)Ag+

    2018-03-02 05:24:20賀氣志羅懷青陳珂珂長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院湖南長(zhǎng)沙4029湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院湖南長(zhǎng)沙40208
    中國(guó)環(huán)境科學(xué) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:信標(biāo)靶標(biāo)探針

    賀氣志,羅懷青,陳珂珂,徐 倩,唐 亮,寧 毅 (.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 4029;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 40208)

    核酸適配體因與金屬離子結(jié)合具有很高的特異性,已被應(yīng)用于新型傳感器的開(kāi)發(fā).已有報(bào)道Ag+能夠特異性的與2個(gè)胞嘧啶(C)結(jié)合形成C-Ag+-C復(fù)合物,富含C的核酸適配體在Ag+存在時(shí)能通過(guò)自由鏈形成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu),基于此已發(fā)展一些具有高度選擇性的生物傳感器用于檢測(cè)Ag+[10-12].盡管核酸適配體探針的特異性很強(qiáng),但是俘獲靶標(biāo)量不大,導(dǎo)致靈敏度不高.

    近年來(lái),信號(hào)放大技術(shù)已逐步被應(yīng)用于高靈敏度臨床檢測(cè)、基因治療和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[13-14].通常通過(guò)納米材料和分子生物學(xué)技術(shù)放大信號(hào),如鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)[15]、連接酶鏈反應(yīng)[16]、靶標(biāo)循環(huán)[17]等.其中基于酶切靶標(biāo)循環(huán)的信號(hào)放大技術(shù),被認(rèn)為是信號(hào)放大的非常有效的方法[18].

    核酸外切酶是一類(lèi)能夠從一端開(kāi)始順次水解磷酸二酯鍵的核酸酶,其產(chǎn)物為單個(gè)核苷酸,廣泛應(yīng)用于傳感器設(shè)計(jì).核酸外切酶III(EXO III)作用于雙鏈DNA,沿3’→5’方向逐步切去單個(gè)核苷酸,無(wú)堿基特異性,但是不能從3’端突起的核酸鏈開(kāi)始降解.最近有報(bào)道利用EXO III的水解特性放大信號(hào)用于檢測(cè)DNA[19-21].由于熒光分析法具有靈敏度高,操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染物檢測(cè)[7,9,22].然而,到目前為止還沒(méi)有基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)原理將分子信標(biāo)與EXO III結(jié)合起來(lái)用于檢測(cè)重金屬離子的研究.

    本研究設(shè)計(jì)熒光分子(FAM))和淬滅基團(tuán)(BHQ)標(biāo)記的分子信標(biāo),利用Ag+核酸適配體的高度特異性并結(jié)合EXO III的酶切特性有效放大熒光檢測(cè)信號(hào)構(gòu)建靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低的快速檢測(cè)Ag+的生物傳感器,為Ag+的檢測(cè)提供新的方法.

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    本研究所用的DNA全部購(gòu)自上海生工生物有限公司,如表1所示.EXO III購(gòu)買(mǎi)于MBI公司.

    表1 設(shè)計(jì)的核苷酸序列Table 1 Oligonucleotides designed in this study

    所有化學(xué)試劑均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán),純度為分析純.將AgNO3溶解于超純水制備所需Ag+濃度.0.02μm濾膜,Milli-Q型純水儀(Millipore,美國(guó)),LS55型熒光分光光度計(jì)(PerkinElmer,美國(guó)),PL203型電子天平(梅特勒一托利多公司,瑞士),DELTA-320pH計(jì)(梅特勒,瑞士).

    1.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化

    反應(yīng)體系的pH值和酶切時(shí)間是影響該方法檢測(cè)效率以及靈敏性的重要因素,因此對(duì)這2個(gè)條件進(jìn)行了優(yōu)化.將Tris-HCl反應(yīng)體系的pH值分別設(shè)定6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8六種不同梯度.分別在不同pH值反應(yīng)體系中將濃度200nmol/LAg+與探針、分子信標(biāo)室溫孵育50min,讓其充分結(jié)合,然后加入EXO III,45min后測(cè)定體系的熒光值.此外,將濃度為200nmol/LAg+與探針、分子信標(biāo)室溫孵育50min,讓其充分結(jié)合,然后加入EXO III,每5min測(cè)定體系的熒光值,對(duì)照組Ag+濃度為0,方法同靶標(biāo)組.本研究所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,取其平均值.

    城市平均投資回報(bào)率是指投資到除港口外的其他產(chǎn)業(yè)平均得到的收益,先把城市內(nèi)上市公司作為樣本,篩選出對(duì)經(jīng)濟(jì)有貢獻(xiàn)的指標(biāo)(如:應(yīng)付職工薪酬、固定資產(chǎn)折舊額、營(yíng)業(yè)利潤(rùn)和稅收等),得到其經(jīng)濟(jì)的貢獻(xiàn)量,再計(jì)算其資產(chǎn)總額的貢獻(xiàn)率。

    1.3 靈敏度分析

    設(shè)定Ag+濃度為0, 0.1, 0.5, 1, 20, 60, 100,150, 200, 300nmol/L,分別加入到探針DNA和分子信標(biāo)混合液中室溫孵育50min,使靶標(biāo)、探針、分子信標(biāo)充分結(jié)合形成特定的空間結(jié)構(gòu).然后加入2U的EXO III,室溫孵育50min,在激發(fā)波長(zhǎng)495nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm 下測(cè)定體系的熒光值.該反應(yīng)體系用Tris-HCl(pH7.4)定容至100μL,探針DNA終濃度為50nmol/L,分子信標(biāo)終濃度為200nmol/L.本研究所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,取其平均值.

    1.4 特異性分析

    為考察該體系的特異,以Ag+為實(shí)驗(yàn)組,以Mn2+、Pb2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+為對(duì)照組,所有離子濃度均為100nmol/L,按上述方法測(cè)定該體系的熒光值.為了進(jìn)一步驗(yàn)證體系的抗干擾能力,將上述7種非靶標(biāo)金屬離子各2μmol/L與200nmol/L Ag+一同加入體系反應(yīng)后,在激發(fā)波長(zhǎng)495nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm下測(cè)定熒光值.

    1.5 對(duì)實(shí)際樣品中Ag+的檢測(cè)

    為考察該方法對(duì)實(shí)際樣品中Ag+檢測(cè)能力,對(duì)湘江水進(jìn)行檢測(cè).因考慮到湘江水含有其他基質(zhì),首先用濾紙進(jìn)行過(guò)濾去除大顆粒物質(zhì),再用0.02μm的超濾膜對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾,再將pH值調(diào)整至7.4[7].將不同濃度梯度的Ag+加入體系,體系中溶液為體積比1:1的湘江水與Tris-HCl (pH7.4),反應(yīng)后在激發(fā)波長(zhǎng)495nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm下測(cè)定熒光值.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 生物傳感器的設(shè)計(jì)原理

    設(shè)計(jì)新型DNA探針,包含中間核酸適配體序列和兩端的與分子信標(biāo)互補(bǔ)序列.當(dāng)體系中不存在Ag+時(shí),分子信標(biāo)與DNA探針在反應(yīng)液中互不干擾,處于游離狀態(tài),分子信標(biāo)兩端的熒光分子和淬滅分子由于距離太近發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移,熒光被猝滅;當(dāng)向體系中加入Ag+時(shí),DNA探針的核酸適配體部分與靶標(biāo)結(jié)合形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)[12],探針的兩端序列則會(huì)拼接起來(lái)與分子信標(biāo)形成互補(bǔ)的雙鏈.加入EXO III后,由于DNA探針3’端的4個(gè)堿基被硫代處理從而能防止其被EXO III酶解[20],因此,EXO III將從分子信標(biāo)的3’端依次降解核酸,使得熒光分子FAM遠(yuǎn)離BHQ而被釋放到溶液中,體系熒光值增大.而靶標(biāo)與探針DNA結(jié)合的復(fù)合物則能與分子信標(biāo)結(jié)合繼續(xù)下一個(gè)循環(huán)反應(yīng),產(chǎn)生更多游離的熒光分子,體系的熒光信號(hào)被不斷放大,如圖1所示.分子信標(biāo)能與探針的兩端拼接互補(bǔ)形成雙鏈?zhǔn)潜倔w系的關(guān)鍵所在.如果DNA探針適配體區(qū)域與分子信標(biāo)互補(bǔ)區(qū)域間隔的堿基數(shù)過(guò)多,將會(huì)導(dǎo)致拼接排列不緊密而影響分子信標(biāo)和探針的結(jié)合效率;如果間隔的堿基數(shù)太少,由于堿基與堿基之間的空間位阻將會(huì)阻礙分子信標(biāo)與探針的結(jié)合.因此設(shè)計(jì)間隔堿基數(shù)分別為0,1,2,3,4 bp的5種探針,分別比較5種探針檢測(cè)相同濃度的Ag+(200nmol/L)得到的信噪比,如圖2所示.P3間隔2個(gè)堿基所產(chǎn)生的信噪比最大,說(shuō)明這種探針與分子信標(biāo)的結(jié)合效果最好,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此探針.P1信噪比接近1,說(shuō)明間隔太短,由于空間位阻,分子信標(biāo)基本不能與探針拼接形成雙鏈.P5信噪比高于1但是低于P3,說(shuō)明間隔太長(zhǎng),分子信標(biāo)與探針的結(jié)合效率不理想.

    圖1 基于分子信標(biāo)和EXO III活性放大信號(hào)對(duì)Ag+檢測(cè)的原理示意Fig.1 Schematic diagram for detection of Ag+ based on molecular beacon and signal amplification assisted by EXO III

    圖2 DNA分子探針的優(yōu)化Fig.2 The optimization of DNA probe

    2.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化

    圖3 檢測(cè)體系pH值和酶切時(shí)間的優(yōu)化Fig.3 The optimization of pH and digestion time of the reaction system

    反應(yīng)體系在不同的pH值條件下,其檢測(cè)的熒光效率表現(xiàn)不同,如圖3(a)所示.pH值為7.4時(shí),體系的熒光值達(dá)到最大,因此可以確定7.4為該體系的最佳pH值,后續(xù)所有實(shí)驗(yàn)均采用此值.分子信標(biāo)與探針互補(bǔ)配對(duì)后,在EXO III的作用下降解分子信標(biāo),釋放游離的FAM,體系熒光值增強(qiáng).但如果酶切時(shí)間不夠,分子信標(biāo)將無(wú)法完全被酶解從而釋放游離的FAM,同時(shí)Ag+/DNA探針復(fù)合物也無(wú)法釋放用于下一輪循環(huán)反應(yīng),這將會(huì)極大的影響檢測(cè)體系的熒光效率和靈敏度.因此,為達(dá)到最佳的檢測(cè)效果和檢測(cè)效率,探索酶切的最佳反應(yīng)時(shí)間.如圖3(b)所示,5~50min內(nèi)隨著酶切時(shí)間延長(zhǎng),熒光值的增加與時(shí)間成直線關(guān)系,50min后體系熒光值幾乎不再改變,結(jié)果表明FAM已完全釋放出來(lái),此時(shí)的熒光效率最佳,因此我們選50min為最佳酶切時(shí)間.

    2.3 靈敏度分析

    圖4 Ag+的靈敏性分析Fig.4 The sensitivity analysis of the method for Ag+

    為考察該檢測(cè)體系的靈敏度,將不同濃度梯度的Ag+分別加入到檢測(cè)體系中,記錄熒光值.如圖4,隨著Ag+濃度的增加, Ag+將與DNA探針形成C-Ag+-C復(fù)合物,探針形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),使得兩端序列拼接起來(lái)與分子信標(biāo)互補(bǔ)形成雙鏈,在EXO III的作用下,分子信標(biāo)水解釋放游離FAM,同時(shí)探針與Ag+形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可以進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)與分子信標(biāo)結(jié)合,產(chǎn)生更多游離的FAM,熒光強(qiáng)度不斷增加.當(dāng)Ag+濃度大于200nmol/L時(shí),熒光強(qiáng)度增加不顯著,說(shuō)明Ag+與DNA探針結(jié)合已達(dá)飽和并形成穩(wěn)定的雜交結(jié)構(gòu),導(dǎo)致分子信標(biāo)被完全酶解,FAM完全釋放.該檢測(cè)體系在Ag+濃度為0.5~200nmol/L范圍內(nèi),熒光值與靶標(biāo)濃度成線性關(guān)系(Y=0.950X+87.55,R2=0.994). Ag+濃度為0.1nmol/L的熒光品均值與背景信號(hào)的比值為3.05,即信噪比大于3具有檢測(cè)意義,因此其檢測(cè)下限(LOD)可達(dá)0.1nmol/L.該檢測(cè)體系比Xu等[10]構(gòu)建的超敏電化學(xué)傳感器操作簡(jiǎn)便,價(jià)格低廉.其LOD低于已報(bào)道的Wen等[23]構(gòu)建基于石墨烯傳感器(1.0nmol/L)、Wei等[7]構(gòu)建的Dnase I介導(dǎo)的納米石墨傳感器(0.3nmol/L).檢測(cè)體系的高靈敏度表明其具有實(shí)際應(yīng)用前景.

    2.4 特異性分析

    圖5 Ag+的特異性分析Fig.5 The specificity analysis of the method for Ag+

    在特異性分析中,將相同濃度的靶標(biāo)離子與其他金屬離子加入反應(yīng)體系中,在相同條件下反應(yīng)后測(cè)定熒光值.如圖5所示,靶標(biāo)離子的熒光值要遠(yuǎn)大于其他非靶標(biāo)金屬離子的熒光值,極易區(qū)分靶標(biāo)離子和非靶標(biāo)離子,因此具有很強(qiáng)的特異性.該體系的高度特異性歸功于DNA探針與Ag+形成C-Ag+-C復(fù)合物的特異性和親和力.進(jìn)一步考察該體系檢測(cè)時(shí)的抗干擾能力,將其他非靶標(biāo)金屬離子和靶標(biāo)離子混合測(cè)定其熒光值,如圖6所示.其他金屬和靶標(biāo)離子混合物的熒光值(曲線1)遠(yuǎn)大于其他金屬混合液(曲線2),并且背景信號(hào)低(曲線3).結(jié)果表明,該方法檢測(cè)靶標(biāo)的

    熒光值與其他混合金屬的熒光值比值為5.5,即信噪比大于3,具有檢測(cè)意義因此具有高度的選擇性,并且在復(fù)雜體系中具有很強(qiáng)的抗干擾能力,優(yōu)于已報(bào)道的電化學(xué)傳感器,碳納米傳感器等[5,7,23].

    圖6 抗干擾能力分析Fig.6 Analysis of the Anti-interference ability

    2.5 樣品的檢測(cè)

    該方法在Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液中具有良好的檢測(cè)性能,而實(shí)際樣品成分比較復(fù)雜,影響因素較多,因此很多檢測(cè)方法在復(fù)雜環(huán)境中的表現(xiàn)不夠穩(wěn)定,難以令人滿(mǎn)意.為了評(píng)價(jià)該方法在復(fù)雜環(huán)境的表現(xiàn)能力,進(jìn)一步檢測(cè)湘江水中含有的Ag+濃度.如圖7所示,熒光值隨著河水中Ag+濃度的增加而增加,并在20~200nmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(R2=0.998).盡管湘江水中存在一定量的礦物質(zhì)和有機(jī)物,但是該方法還是能很好地檢測(cè)出Ag+濃度,且最低檢測(cè)下限可達(dá)10nmol/L,低于世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)飲用水的標(biāo)準(zhǔn)(0.1mg/L).此外,為了探討樣品中其他物質(zhì)對(duì)檢測(cè)體系的影響,我們對(duì)樣品中的Ag+進(jìn)行回收,結(jié)果表明回收率達(dá)到99.1%~103%,其相對(duì)誤差處于1.0%~3.2%之間,如表2所示.由標(biāo)回收率及相對(duì)誤差證實(shí)該檢測(cè)方法在樣品中也具有很好的表現(xiàn).因此該方法具有較大的實(shí)際應(yīng)用潛力.

    圖7 實(shí)際樣品中Ag+的靈敏性分析Fig.7 The sensitivity analysis of the method for Ag+ in real samples

    表2 實(shí)際分析樣品中Ag+ 的回收率Table 2 Recoveries of the proposed Ag+ assay in real samples

    圖8 實(shí)際樣品中Ag+的特異性分析Fig.8 The specificity analysis of the method for Ag+ in real samples

    為驗(yàn)證該生物傳感器在實(shí)際樣品中的特異性表現(xiàn),對(duì)含有濃度均為150nmol/L的靶標(biāo)離子與其他金屬離子的湘江水樣品進(jìn)行檢測(cè).如圖8所示,其他非靶標(biāo)金屬離子的熒光值遠(yuǎn)低于靶標(biāo)離子的熒光值,因此該傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中同樣具有的很好特異性.

    3 討論

    本研究設(shè)計(jì)了一種操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)和靈敏度高的DNA探針,構(gòu)建了基于分子信標(biāo)和EXO III的熒光信號(hào)放大的生物傳感器用于Ag+的檢測(cè).

    DNA探針中間部分為適配體序列,兩端為分子信標(biāo)互補(bǔ)配對(duì)的序列.因?yàn)镋XO II只能水解雙鏈DNA3’端的平端和凹斷,不能酶切凸端,在探針3’端多出4個(gè)堿基處于單鏈狀態(tài),避免被EXO III酶切.當(dāng)DNA探針與Ag+結(jié)合后形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),兩端序列通過(guò)拼接與分子信標(biāo)互補(bǔ)形成雙鏈,但如果拼接部分沒(méi)有間隔堿基,空間位阻大,分子信標(biāo)則不能與之結(jié)合形成雙鏈,相反如果距離過(guò)大,也會(huì)影響雙鏈的形成,降低檢測(cè)效果.所以有必要探究探針的設(shè)計(jì).

    在分子信標(biāo)與DNA探針與Ag+形成復(fù)合物雙鏈后加入EXO III,EXO III在體系中水解分子信標(biāo)從而釋放游離的熒光分子,使得探針與靶標(biāo)復(fù)合物進(jìn)入下一個(gè)循環(huán),再與分子信標(biāo)結(jié)合,熒光信號(hào)被循環(huán)放大.因此酶切時(shí)間是影響該方法檢測(cè)的關(guān)鍵因素[7].

    檢測(cè)方法的靈敏度和選擇性是評(píng)價(jià)優(yōu)劣的關(guān)鍵.有很多研究報(bào)道利用Ag+核酸適配體結(jié)合碳納米材料,該方法選擇性高,但是1個(gè)靶標(biāo)離子只能釋放1個(gè)熒光分子,熒光強(qiáng)度低,方法的靈敏度不夠高,且操作繁瑣.也有很多研究報(bào)道基于Ag+核酸適配體的電化學(xué)傳感器,該方法的靈敏度較高,但是傳感器構(gòu)建復(fù)雜,操作繁瑣,還需特定昂貴的儀器設(shè)備.本研究利用核酸適配體結(jié)合分子信標(biāo)和EXO III,使Ag+和適配體復(fù)合物反復(fù)與分子信標(biāo)結(jié)合,然后水解產(chǎn)生FAM,一個(gè)靶標(biāo)可產(chǎn)生多個(gè)熒光分子,因此熒光強(qiáng)度不斷被放大,靈敏度顯著提高,而且該方法操作簡(jiǎn)便,成本低廉,也無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備,極容易在基層實(shí)驗(yàn)室完成Ag+檢測(cè),因此具有很強(qiáng)的實(shí)用性.

    很多方法在緩沖液中的檢測(cè)效果好,但是在實(shí)際樣品中的檢測(cè)卻差強(qiáng)人意.電化學(xué)傳感器很容易受復(fù)雜環(huán)境中帶電物質(zhì)的影響,從而影響傳感器的表現(xiàn)[24].本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化各類(lèi)實(shí)驗(yàn)條件并通過(guò)水樣品的抗干擾實(shí)驗(yàn)證明該方法在實(shí)際樣品具有很高的靈敏性和很強(qiáng)的特異性,因此在污水、食品與中藥等樣品的檢測(cè)中具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值.

    4 結(jié)論

    4.1 DNA探針適配體區(qū)域與分子信標(biāo)互補(bǔ)區(qū)域間隔堿基數(shù)為2個(gè)堿基時(shí)檢測(cè)的信噪比最大,說(shuō)明這種探針與分子信標(biāo)的結(jié)合能力最好.

    4.2 在DNA探針與Ag+形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),其兩端與分子信標(biāo)形成雙鏈后加EXO III,酶切的最佳時(shí)間為50min,檢測(cè)的熒光值最大,檢測(cè)效率最高.

    4.3 將靶標(biāo)離子加入到探針DNA和分子信標(biāo)混合液中室溫孵育50min,再加入2U的EXO III,室溫育50min,設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)495nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm測(cè)定體系的熒光光譜.其檢測(cè)下限(LOD)低至0.1nmol/L,且在Ag+濃度為0.5~200nmol/L范圍內(nèi),熒光值與靶標(biāo)濃度成線性關(guān)系(R2=0.994).

    4.4 該方法的特異性高,在檢測(cè)體系中加入非靶標(biāo)離子,其熒光值很低基本等同于背景信號(hào).當(dāng)將大量非靶標(biāo)離子和200nmol/L Ag+加入體系測(cè)得的熒光值是非靶標(biāo)離子檢測(cè)的熒光值的6倍,說(shuō)明該方法抗干擾能力強(qiáng).

    4.5 該方法在檢測(cè)湘江水實(shí)際樣品中的Ag+時(shí),在0~200nmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(R2=0.998),其檢測(cè)下限可達(dá)到10nmol/L,低于世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)飲用水的標(biāo)準(zhǔn)(0.1mg/L),且特異性強(qiáng).因此該方法具有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.

    4.6 該方法操作簡(jiǎn)單,成本低,不需要特殊昂貴的儀器設(shè)備,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不到2h,檢測(cè)速度快.

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