以橘渣為原料間歇振蕩法生產(chǎn)細(xì)菌纖維素

楊 穎，唐偉敏，邢建榮，鄭美瑜，陸勝民

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，浙江 杭州 310021)

細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是通過(guò)微生物發(fā)酵作用形成的，由β-D- 葡萄糖通過(guò)β- 1，4- 糖苷鍵結(jié)合成的直鏈，又稱為β- 1，4- 葡聚糖[1]。BC產(chǎn)生菌較多，其中葡糖酸醋桿菌屬的高產(chǎn)菌較多，生產(chǎn)方式主要有靜置與振蕩培養(yǎng)2種。靜置培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)液表面長(zhǎng)出凝膠狀厚膜[2-3]，因外觀類似椰肉，又稱“椰果”，具有飽腹感，以及清理腸道與減肥效果，作為配料廣泛應(yīng)用于食品與特殊材料領(lǐng)域[4-9]。連續(xù)振蕩培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)轉(zhuǎn)速、裝液量、培養(yǎng)基成分不同，形成球狀、絮狀、星狀等不同形狀的凝膠團(tuán)，主要作為新奇食品配料或者特殊材料應(yīng)用[10-13]。

BC生產(chǎn)基質(zhì)主要有化學(xué)培養(yǎng)基與復(fù)合培養(yǎng)基2種：化學(xué)培養(yǎng)基以HS為代表，價(jià)格較貴且產(chǎn)量不高，多用于研究分析[14-15]；復(fù)合培養(yǎng)基以椰子水、菠蘿渣為基質(zhì)復(fù)配，價(jià)格較低且產(chǎn)量較高[16-18]。柑橘是世界第一大水果，加工集中度高，橘渣產(chǎn)量大且易于獲得，以其為原料生產(chǎn)BC能夠充分利用自然資源，是一個(gè)值得關(guān)注的研究方向。作者在前期研究時(shí)從腐敗柑橘表面獲得1株中間葡糖酸醋桿菌CIs26，橘渣水能夠顯著提高其BC產(chǎn)量[19]。當(dāng)其靜置培養(yǎng)時(shí)，形成的凝膠膜較硬，改變培養(yǎng)方式時(shí)發(fā)現(xiàn)，靜置與短時(shí)振蕩間歇培養(yǎng)能夠形成較疏松的軟膜，且持水性、復(fù)水性更好，是制備脆嫩型納塔、藥物緩釋系統(tǒng)、透氣敷料的潛在原料?；诖耍疚囊訡Is26為發(fā)酵菌株，采用間歇振蕩培養(yǎng)方式，研究以橘渣為基質(zhì)的培養(yǎng)基復(fù)配方案，為擴(kuò)大BC生產(chǎn)的原料來(lái)源、豐富BC生產(chǎn)的工藝條件等提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

發(fā)酵菌株：中間葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterintermedius)CIs26，本實(shí)驗(yàn)室自行篩選、鑒定。

橘渣制備：溫州蜜柑去皮榨汁。殘?jiān)梢粤⒓词褂?，也可以冷凍保存后解凍使用?/p>

橘渣水的配制：橘渣與水混合打漿，添加果膠酶與纖維素酶，45 ℃保溫2 h，800目濾布過(guò)濾，所得濾液為橘渣水。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蔗糖30 g，(NH4)2SO45 g，橘渣水1 L，自然pH值，121 ℃滅菌15 min。

HS培養(yǎng)基：參考Hestrin等[20]的配方，121 ℃滅菌15 min。

橘渣水復(fù)配HS培養(yǎng)基：以橘渣水替代蒸餾水，其他同HS培養(yǎng)基。

果膠酶(200 000 U·g-1)、纖維素酶(100 000 U·g-1)，購(gòu)于寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；酵母粉購(gòu)于浙江杭富生物制品廠；常規(guī)藥品購(gòu)于華東醫(yī)藥有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

雙層恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Elx800TM全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；超低溫冰箱，美國(guó)NBS公司；LXJ- IIB高容量低轉(zhuǎn)速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PB- 10精密pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；Quick- Brix90TM糖度計(jì)，梅特勒- 托利多國(guó)際股份有限公司；85- 2恒溫磁力攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司；DS- 1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵曲線繪制

180 μL培養(yǎng)基添加于酶標(biāo)板微孔中，接入活化種子液10 μL，30 ℃搖床培養(yǎng)，每隔1 h 150 r·min-1轉(zhuǎn)動(dòng)搖床5 min，每6 h測(cè)定1次D450，取3組數(shù)據(jù)平均值繪制發(fā)酵曲線。

1.3.2 渣水比選擇

橘渣與水分別按質(zhì)量比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10及1∶12混合，打漿，過(guò)濾，以濾液代替去離子水配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基，滅菌，接種，按1.3.1節(jié)方法繪制發(fā)酵曲線。

1.3.3 橘渣酶解條件

橘渣與水混合打漿，添加不同濃度的果膠酶與纖維素酶，45 ℃保溫2 h，過(guò)濾取濾液復(fù)配、滅菌、接種，按1.3.1節(jié)方法繪制發(fā)酵曲線。

1.3.4 最適碳源及濃度

取橘渣水配制30 g·L-1不同碳源的培養(yǎng)基(蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖及鼠李糖)，滅菌，接種，按1.3.1節(jié)方法繪制發(fā)酵曲線。配制不同碳源濃度(30、40、50、60、70、90 g·L-1)的培養(yǎng)基，滅菌，接種，按1.3.1節(jié)方法繪制發(fā)酵曲線。

1.3.5 最適氮源及濃度

取橘渣水配制5 g·L-1不同氮源的培養(yǎng)基(硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏)，滅菌，接種，按1.3.1節(jié)方法繪制發(fā)酵曲線。配制不同氮源濃度(0、1、3、5、7、9 g·L-1)的培養(yǎng)基，滅菌，接種，按1.3.1節(jié)方法繪制發(fā)酵曲線。

1.3.6 最適酵母粉濃度

取橘渣水配制不同酵母粉濃度(0、1、3、5、7、9 g·L-1)的培養(yǎng)基，滅菌，接種，按1.3.1節(jié)方法繪制發(fā)酵曲線。

1.3.7 有機(jī)酸的影響

取橘渣水配制2 g·L-1不同有機(jī)酸種類的培養(yǎng)基(檸檬酸、醋酸、乳酸)，滅菌，接種，按1.3.1節(jié)方法繪制發(fā)酵曲線。配制不同濃度(0、1、2、3、4 g·L-1)有機(jī)酸培養(yǎng)基，滅菌，接種，按1.3.1節(jié)方法繪制發(fā)酵曲線。

1.3.8 最適磷酸氫二鈉濃度

取橘渣水配制不同濃度(0、1、2、3 g·L-1)磷酸氫二鈉培養(yǎng)基，滅菌，接種，按1.3.1節(jié)方法繪制發(fā)酵曲線。

1.3.9 BC干重

500 mL三角瓶裝150 mL培養(yǎng)液，按1.3.1節(jié)方法接種培養(yǎng)，5 d后將BC凝膠取出，無(wú)菌水清洗去除雜質(zhì)，浸泡于0.1 mol·L-1的NaOH溶液中，80 ℃水浴60 min，以去離子水反復(fù)浸泡沖洗至中性，85 ℃烘干至質(zhì)量恒定，稱量。

2 結(jié)果與分析

2.1 渣水比對(duì)發(fā)酵的影響

由圖1可見，當(dāng)渣水比為1∶6時(shí)D450值最高，此時(shí)BC產(chǎn)量也最高，達(dá)6.72 g·L-1，其次為1∶8，BC產(chǎn)量為6.03 g·L-1，再次為1∶4，BC產(chǎn)量為5.26 g·L-1，1∶2時(shí)發(fā)酵液D450值與BC產(chǎn)量均最低。橘渣太濃或者太稀皆不利于BC軟凝膠的形成，原因可能是橘渣中含有部分抑制CIs26菌株生長(zhǎng)或者限制BC積累的物質(zhì)，而太稀時(shí)橘渣溶液中糖類、維生素、氨基酸及微量元素濃度太低，對(duì)菌株生長(zhǎng)促進(jìn)作用不大。本研究選擇渣水比為1∶6。

圖1 渣水比對(duì)CIs26發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of dregs- water ratio on fermentation of CIs26

2.2 酶處理?xiàng)l件對(duì)發(fā)酵的影響

橘渣中含有大量的果膠與纖維素，打漿后溶液黏度較高，過(guò)濾困難，濾液可溶性固形物含量低，仍剩余30%左右的濾渣需要處理。先以果膠酶對(duì)橘渣漿進(jìn)行降解，再添加不同濃度的纖維素酶進(jìn)行酶解，研究酶解對(duì)CIs26菌株發(fā)酵情況的影響，結(jié)果如圖2所示。

添加0.3 g·L-1果膠酶時(shí)發(fā)酵液的濁度最高，BC產(chǎn)量也最高，達(dá)6.81 g·L-1，選擇果膠酶濃度為0.3 g·L-1。果膠酶復(fù)配纖維素酶能夠有效地提高發(fā)酵液的濁度，復(fù)配0.1 g·L-1纖維素酶較不復(fù)配組BC產(chǎn)量提高了1.51 g·L-1。原因可能是果膠酶與纖維素酶復(fù)合酶解，能夠充分釋放被果膠、纖維素等大分子纏繞包裹的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)降低培養(yǎng)液黏度，增加溶氧量。本研究選擇0.3 g·L-1的果膠酶復(fù)合0.1 g·L-1的纖維素酶對(duì)橘渣漿進(jìn)行酶解。

a，單獨(dú)使用果膠酶；b，果膠酶與纖維素酶復(fù)配a， Pectinase only; b. both pectinase and cellulase圖2 酶添加比例對(duì)CIs26發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of enzyme amount on fermentation of CIs26

2.3 碳源種類及濃度對(duì)發(fā)酵的影響

由圖3- a可見，CIs26發(fā)酵生產(chǎn)BC的最適碳源是葡萄糖，在80 h左右D450即達(dá)到最大值，放大培養(yǎng)時(shí)其BC產(chǎn)量達(dá)8.13 g·L-1，果糖次之，蔗糖緊隨其后，甘露醇最差。以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，CIs26發(fā)酵液的D450值迅速上升，到達(dá)最高點(diǎn)時(shí)緩慢下降，可能與發(fā)酵后期有機(jī)酸的含量上升有關(guān)。當(dāng)以蔗糖為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液的D450值到達(dá)高點(diǎn)后保持平穩(wěn)態(tài)勢(shì)，其原因還有待進(jìn)一步研究。綜合考慮發(fā)酵效率與產(chǎn)品成本，本研究選擇蔗糖為碳源。

由圖3- b可見，蔗糖濃度70 g·L-1時(shí)發(fā)酵液的濁度最高，放大培養(yǎng)時(shí)BC產(chǎn)量達(dá)8.06 g·L-1，其次為60 g·L-1，30 g·L-1時(shí)最低。實(shí)際生產(chǎn)時(shí)考慮成本問(wèn)題，可以選擇60 g·L-1或70 g·L-1，本研究選擇蔗糖濃度為70 g·L-1。

2.4 氮源種類及濃度對(duì)CIs26發(fā)酵的影響

由圖4- a可見，試驗(yàn)所選用的3種氮源對(duì)CIs26發(fā)酵無(wú)明顯影響，其中以硫酸銨發(fā)酵效果最好，且價(jià)格最低，故選擇其作為CIs26發(fā)酵的氮源。由圖4- b可見，硫酸銨濃度對(duì)菌株發(fā)酵影響相對(duì)較小，添加量以3 g·L-1效果較佳。

圖3 碳源種類(a)和蔗糖濃度(b)對(duì)CIs26發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of carbon sources (a) and sucrose concentrations (b) on fermentation of CIs26

圖4 氮源種類(a)及硫酸銨濃度(b)對(duì)CIs26發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources (a) and ammonium sulphate concentrations (b) on fermentation of CIs26

2.5 酵母粉濃度對(duì)CIs26發(fā)酵的影響

由圖5可見，酵母粉能夠有效提高CIs26的發(fā)酵效率，且隨著其添加濃度升高，發(fā)酵液的D450值呈上升趨勢(shì)，BC產(chǎn)量也由4.31 g·L-1增加至6.57 g·L-1，與靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)類似[21]，當(dāng)酵母粉濃度增加至7 g·L-1時(shí)上升速度減緩，與9 g·L-1時(shí)效果接近。綜合考慮發(fā)酵效率與生產(chǎn)成本，選擇酵母粉濃度為7 g·L-1。

2.6 有機(jī)酸種類及濃度對(duì)CIs26發(fā)酵的影響

由圖6可見，醋酸、檸檬酸、乳酸對(duì)CIs26發(fā)酵均有促進(jìn)作用，與前期部分研究類似[22]。其原因可能是有機(jī)酸能夠參與菌體的物質(zhì)或能量代謝，刺激發(fā)酵早期的菌體繁殖，從而提高BC產(chǎn)量。乳酸的效果優(yōu)于其他2種，其適宜添加量為1 g·L-1，過(guò)高不利于BC積累。

圖5 酵母粉濃度對(duì)CIs26發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of yeast extract concentrations on fermentation of CIs26

圖6 有機(jī)酸種類(a)及乳酸濃度(b)對(duì)CIs26發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of organic acids (a) and lactic acid concentrations (b) on fermentation of CIs26

2.7 磷酸氫二鈉濃度對(duì)CIs26發(fā)酵的影響

CIs26在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸，積累到一定程度會(huì)對(duì)自身生長(zhǎng)、發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用。由圖7可見，添加磷酸氫二鈉能促進(jìn)CIs26的生長(zhǎng)，增加發(fā)酵液渾濁度。添加2 g·L-1與3 g·L-1時(shí)D450值相差不大，故選擇磷酸氫二鈉添加量為2 g·L-1。

2.8 不同營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)CIs26發(fā)酵的影響

將活化好的CIs26菌株分別接種于HS培養(yǎng)基、橘渣水復(fù)配HS培養(yǎng)基、本研究?jī)?yōu)化培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，30 ℃發(fā)酵5 d后，BC產(chǎn)量分別為4.51、6.75、10.26 g·L-1，優(yōu)化培養(yǎng)基條件下的BC產(chǎn)量是HS培養(yǎng)基上的2.27倍、橘渣水復(fù)配HS培養(yǎng)基上的1.52倍，可見橘渣對(duì)于菌株的BC生成具有促進(jìn)作用。

圖7 磷酸氫二鈉對(duì)對(duì)CIs26發(fā)酵的影響Fig.7 Effects of hydrogen phosphate on fermentation of CIs26

3 小結(jié)與討論

本論文以篩選自腐敗柑橘表面的中間葡糖酸醋桿菌CIs26為發(fā)酵菌株，研究間歇振蕩法生產(chǎn)BC的營(yíng)養(yǎng)條件，確定基于橘渣的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)復(fù)配方案如下：橘渣與水的混合比例為1∶6，太濃或者太稀皆不利于BC積累；橘渣與水混合均勻打漿制備橘渣漿，添加0.3 g·L-1的果膠酶、0.1 g·L-1的纖維素酶，于45 ℃酶解2 h，過(guò)濾所得濾液為培養(yǎng)基液；選擇蔗糖為碳源，濃度70 g·L-1，硫酸銨為氮源，濃度3 g·L-1，酵母粉為生長(zhǎng)因子，濃度為7 g·L-1，并添加1 g·L-1的乳酸與2 g·L-1磷酸氫二鈉。在優(yōu)化條件下，BC產(chǎn)量達(dá)10.26 g·L-1，是HS培養(yǎng)基上的2.27倍。

我國(guó)的BC發(fā)酵集中在海南，主要以當(dāng)?shù)氐囊铀疄榛|(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)，BC產(chǎn)量受產(chǎn)地與椰子產(chǎn)量的限制。我國(guó)柑橘產(chǎn)量大、產(chǎn)地廣，加工集中，橘渣易于收集，冷凍后不影響使用，能夠?qū)崿F(xiàn)周年供應(yīng)，是工業(yè)化生產(chǎn)BC的良好基質(zhì)。本研究結(jié)果可為擴(kuò)大BC生產(chǎn)的原料來(lái)源、提高BC產(chǎn)量、改變生產(chǎn)工藝等提供新思路。此外，既有的BC培養(yǎng)方式以靜置與振蕩培養(yǎng)為主，間歇振蕩法生產(chǎn)所得BC凝膠有獨(dú)特的性能，但還未見相關(guān)報(bào)道，是一個(gè)值得關(guān)注的研究方向。同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)間歇振蕩對(duì)BC性能影響的相關(guān)研究。

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