免疫膠體金法快速檢測(cè)水產(chǎn)品中喹諾酮類(lèi)藥物

柳愛(ài)春，劉 超，張 樂(lè)，童朝明，李 鋒，趙 蕓

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

我國(guó)水產(chǎn)品養(yǎng)殖總產(chǎn)量居世界首位，養(yǎng)殖過(guò)程中的藥物殘留問(wèn)題備受?chē)?guó)內(nèi)外關(guān)注。近10 a來(lái)，喹諾酮類(lèi)(quinolones，QNs)藥物殘留是造成我國(guó)水產(chǎn)品抽檢不合格的主要原因之一。QNs是一類(lèi)化學(xué)合成的抗菌藥，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)以預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病[1-5]。研究表明，QNs在動(dòng)物體內(nèi)可發(fā)生轉(zhuǎn)化和富集現(xiàn)象[6-7]，造成動(dòng)物性食品中藥物殘留[8-9]，而且還有部分藥物會(huì)隨著動(dòng)物排泄物在環(huán)境中發(fā)生遷移[10-11]。QNs對(duì)人體的危害包括影響兒童和胎兒的骨骼發(fā)育，引起頭暈、關(guān)節(jié)病變、消化道反應(yīng)、肝腎毒性等。QNs在環(huán)境中殘留還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[12-13]。美國(guó)現(xiàn)已禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中使用QNs，殘留限量為5 μg·kg-1，但QNs在我國(guó)、歐盟和日本是允許使用的，農(nóng)業(yè)部293號(hào)公告規(guī)定水產(chǎn)品肌肉中殘留限量為100 μg·kg-1。然而，依據(jù)農(nóng)業(yè)部2292號(hào)公告，自2016年12月31日起，禁止在食品用動(dòng)物養(yǎng)殖中使用QNs藥物中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星，與之相關(guān)的5 000多個(gè)獸藥批號(hào)被取消。

目前，對(duì)水產(chǎn)品中QNs藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)的方法主要有液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法(LC- MS/MS)(GB/T 21312—2007)和高效液相色譜法(HPLC)(農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告- 2- 2006)，但這些方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高的問(wèn)題，難以滿(mǎn)足對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管的時(shí)效性要求。免疫膠體金法(GICT)以其操作簡(jiǎn)便、快速、直觀等特點(diǎn)，成為藥物殘留快速篩檢的有效方法。農(nóng)業(yè)部自2011年以來(lái)，每年開(kāi)展對(duì)水產(chǎn)品快速檢測(cè)產(chǎn)品的驗(yàn)證工作，促進(jìn)了快速檢測(cè)產(chǎn)品的改進(jìn)和發(fā)展。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)對(duì)喹諾酮類(lèi)抗體和快速檢測(cè)產(chǎn)品的研究和開(kāi)發(fā)工作不斷深入[14-15]，吳建祥等[16]研制的單克隆抗體對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的50%抑制率(IC50)分別達(dá)3.21、8.15、7.75、6.21 ng·mL-1，可滿(mǎn)足當(dāng)時(shí)我國(guó)、歐盟和日本對(duì)QNs殘留檢測(cè)的需求。2017年隨著農(nóng)業(yè)部2292號(hào)公告的實(shí)施，對(duì)單克隆抗體和快速檢測(cè)產(chǎn)品靈敏度的要求進(jìn)一步提高。本研究針對(duì)4種禁用QNs藥物開(kāi)展免疫膠體金試劑盒的研制工作，并將其應(yīng)用于水產(chǎn)品中QNs藥物殘留的快速篩檢，以期為水產(chǎn)品市場(chǎng)準(zhǔn)入制度和基地準(zhǔn)出制度的實(shí)施提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

產(chǎn)QNs抗體的雜交瘤細(xì)胞株(實(shí)驗(yàn)室自制)，株號(hào)5H1E9E8D7H12，簡(jiǎn)稱(chēng)QH12，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號(hào)CCTCC No.C2015118，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01510990139.X。水產(chǎn)樣品來(lái)自浙江省內(nèi)各個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，取魚(yú)、蝦、鱉等可食部分約100 g，用組織搗碎機(jī)充分絞碎混勻，-18 ℃冷凍避光保存。

1.1.2 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基，GIBCO；胎牛血清(FBS)，GIBCO；1307鍍劑、氯金酸(純度99.99%)、膠體金墊和NC膜，上海捷寧公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。金標(biāo)抗體保存液：0.02 mol·L-1Tris- HCl緩沖液(pH 8.7，含0.2% PEG20000、1%BSA和3%海藻糖，現(xiàn)配現(xiàn)用)。喹諾酮類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氟甲喹(flumequine，F(xiàn)lu)，諾氟沙星(norfloxacin，Nor)，依諾沙星(enoxacin，Eno)，環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，Cip)，培氟沙星(pefloxacin，Pef)，洛美沙星(lomefloxacin，Lom)，達(dá)氟沙星(danofloxacin，Dan)，恩諾沙星(enrofloxacin，Enr)，氧氟沙星(ofloxacin，Ofl)，麻保沙星(marbofloxacin，Mar)，沙拉沙星(sarafloxacin，Sar)，二氟沙星(difloxacin，Dif)，均為德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)的純品型有證標(biāo)準(zhǔn)品。乙腈、甲醇、正己烷均為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo 3111，美國(guó)；酶標(biāo)儀，Tecan Infinite M1000，瑞士；紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津UV3550，日本；三維噴點(diǎn)平臺(tái)，BIODOT 3210，美國(guó)；空氣吹干機(jī)，定制；高效液相色譜儀/HPLC，Waters e2695，美國(guó)；超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀/UPLC- MS/MS，Waters TQ- S，美國(guó)。

1.2 免疫膠體金試劑條研制

1.2.1 體外抗體制備

將QH12雜交瘤細(xì)胞株復(fù)蘇，加入適量RPMI 1640培養(yǎng)基(含10% FBS)，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。更換培養(yǎng)基時(shí)，收集舊培養(yǎng)基，取少量用ELISA方法檢測(cè)抗體靈敏度，其余的培養(yǎng)基中立即加入等體積的飽和硫酸銨，搖勻后，4 ℃靜置2～16 h。10 000g離心30 min，棄上清，向沉淀中慢慢加入0.02 mol·L-1(pH 7.2)的PBS，并攪拌至沉淀完全溶解，10 000g離心30 min，留上清液，用40%飽和硫酸銨沉淀，獲初步純化的抗體。再用PBS復(fù)溶，用紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定280 nm處的吸光值，并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，分裝后，-86 ℃凍存。取部分抗體用Protein G法進(jìn)一步純化，冷凍干燥后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫膠體金試劑條研制

(1)膠體金制備。取6個(gè)250 mL三角瓶，預(yù)先用硫酸- 重鉻酸鉀洗液浸泡過(guò)夜，沖洗干凈后，烘干，備用。實(shí)驗(yàn)組(編號(hào)①～③)以2 mL 1307鍍劑涂抹內(nèi)壁，倒出多余液體，倒置，60 ℃烘干；對(duì)照組(編號(hào)④～⑥)未用1307鍍劑處理。每個(gè)三角瓶各加100 mL水，加入0.1%氯金酸水溶液1 mL，在磁力攪拌器上加熱至冒泡，加入1 mL 1%檸檬酸三鈉水溶液，保持微沸15 min，冷卻后，4 ℃保存過(guò)夜。取3 mL膠體金溶液，在紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)上進(jìn)行200～800 nm光譜掃描，測(cè)定吸收峰波長(zhǎng)和吸收值。

(2)膠體金標(biāo)記。將凍干抗體用0.01 mol·L-1的PB緩沖液(pH 7.4)配制成0.5 mg·mL-1的溶液，20 000g離心60 min，去除蛋白聚合物。將100 mL膠體金用0.1 mol·L-1Tris- HCl調(diào)節(jié)pH至8.7。在6支小試管中各加1 mL膠體金，分別按表1所列的抗體量進(jìn)行預(yù)標(biāo)記，每管加10 μg BSA結(jié)合未標(biāo)記的膠體金。將2 μL金標(biāo)抗體溶液滴在裝空白膠體金墊的試劑條上，分別測(cè)試加PBS或5 ng·mL-1Cip后T線(xiàn)(檢測(cè)線(xiàn))和C線(xiàn)(質(zhì)控線(xiàn))的顯色情況和抑制效果。取60 mL膠體金，以最佳抗體量進(jìn)行標(biāo)記，15 000g離心30 min，棄上清液，保留底部紫紅色的金標(biāo)抗體，加入3 mL金標(biāo)抗體保存液使其復(fù)溶，4 ℃保存過(guò)夜。

(3)試劑條制備。用三維噴點(diǎn)平臺(tái)將金標(biāo)抗體噴在膠體金墊上，37 ℃烘干，與T線(xiàn)和C線(xiàn)分別噴有抗原(實(shí)驗(yàn)室人工合成的Cip- BSA)和二抗(羊抗鼠)的NC膜一起組裝成免疫膠體金測(cè)向?qū)游鲈噭l，加塑料卡后，稱(chēng)其為試劑板，并以鋁箔袋單個(gè)包裝。

(4)檢出限測(cè)試。以0.02 mol·L-1(pH 7.2)的PBS分別配制0.5～100 ng·mL-1的環(huán)丙沙星、洛美沙星、諾氟沙星、氧氟沙星和培氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液。從鋁箔袋中取出試劑板，平放，每個(gè)試劑條加3滴標(biāo)準(zhǔn)溶液(簡(jiǎn)稱(chēng)為“滴板”)，3～5 min內(nèi)觀察顯色結(jié)果。定性判定原則：T線(xiàn)比C線(xiàn)淺為陽(yáng)性；T線(xiàn)比C線(xiàn)深或一樣深淺為陰性。以肉眼可識(shí)別出色差的最少濃度為該藥物的最低檢出限(LOD)。以同樣的方法測(cè)試恩諾沙星、沙拉沙星等其他喹諾酮類(lèi)藥物的檢測(cè)限。

(5)交叉反應(yīng)。分別以100 ng·mL-1氯霉素和1 mg·L-1鏈霉素、四環(huán)素或磺胺嘧啶進(jìn)行交叉反應(yīng)。

1.3 樣品預(yù)處理方法優(yōu)化

取一個(gè)經(jīng)LC- MS/MS檢測(cè)的陰性淡水魚(yú)樣，每份稱(chēng)取2.00 g勻質(zhì)樣品于5 mL離心管中，按以下4種樣品預(yù)處理方法分別做添加回收試驗(yàn)，每種方法的每個(gè)添加水平做6次平行試驗(yàn)。

A：加4 mL含1%甲酸的乙腈劇烈振蕩5 min，2 000g離心5 min，上清液移到另一支5 mL試管中，用空氣吹干機(jī)將溶劑吹至近干，加0.5 mL PBS溶解殘留物，加0.5 mL正己烷，用小滴反復(fù)吹打試管內(nèi)壁，靜置5 min，吸取下層溶液滴板。

B：按A法提取，將溶劑吹至全干。

C：加入4 mL快速提取液(含1%甲酸的乙腈與乙酸乙酯以體積比1∶8混合)，劇烈振蕩5 min，2 000g離心5 min，上清液移到另一支5 mL試管中，用空氣吹干機(jī)將溶劑吹至近干，加0.5 mL PBS溶解殘留物，加0.5 mL正己烷，用小滴反復(fù)吹打試管內(nèi)壁，靜置5 min，吸取下層溶液滴板。

D：加入4 mL PBS，劇烈振蕩后，取其懸濁液直接滴板。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)選預(yù)處理方法，并進(jìn)一步完成蝦、甲魚(yú)及其他水產(chǎn)樣品的添加回收試驗(yàn)。

1.4 實(shí)際樣品對(duì)比檢測(cè)與驗(yàn)證

1.4.1 與HPLC法對(duì)比

采集169個(gè)水產(chǎn)樣品，分別按以下部位取樣：魚(yú)、黃鱔和泥鰍去皮，沿脊背取肌肉；鱉取可食部分(肌肉和性腺)；對(duì)蝦和小龍蝦去頭、皮和腸腺，取整條蝦肉；青蛙，去頭，去皮，取肌肉。取好的樣品分別絞碎后備用。參照農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告- 2- 2006，以HPLC法定量檢測(cè)Cip、Enr和Nor殘留量，同時(shí)以1.3節(jié)中的C方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，并用免疫膠體金試劑條定性檢測(cè)喹諾酮類(lèi)藥物總殘留量。

1.4.2 不同免疫膠體金方法對(duì)比

取HPLC檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的鱉樣品，分別用1.3節(jié)的C法和D法進(jìn)行預(yù)處理，同時(shí)用組織滲出液直接滴板，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果。

1.4.3 LC- MS/MS方法確證檢測(cè)

選取10個(gè)HPLC和GICT檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的樣品、10個(gè)HPLC檢測(cè)結(jié)果為陰性而GICT為陽(yáng)性的樣品、3個(gè)HPLC檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性而GICT為陰性的樣品，用LC- MS/MS法進(jìn)行確證檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫膠體金試劑條研制

2.1.1 體外抗體制備結(jié)果

QH12雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)獲得4.4 g初步純化的抗體，經(jīng)競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)試，對(duì)Cip的IC50為0.4 ng·mL-1。與傳統(tǒng)的體內(nèi)抗體制備方法比較，體外抗體制備方法的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)量高，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的依存度低，缺點(diǎn)是細(xì)胞上清中抗體易被降解，因此要及時(shí)用硫酸銨沉淀法分離抗體。

2.1.2 膠體金紫外- 可見(jiàn)光200～800 nm掃描結(jié)果

以0.01 mol·L-1Tris- HCl作對(duì)照，用紫外- 可見(jiàn)光在波長(zhǎng)200～800 nm范圍內(nèi)對(duì)膠體金進(jìn)行掃描(圖1)，3個(gè)平行試驗(yàn)的吸收曲線(xiàn)和吸收峰均高度一致：λ①max=529.5 nm，λ②max=λ③max=529.0 nm，D①529.5nm=0.943，D②529.0 nm=0.944，D③529.0 nm=0.950。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式λ=0.427 1φ+514.56計(jì)算出膠體金粒徑φ①=35 nm，φ③=φ③=34 nm。對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組掃描圖可知，使用1307鍍劑處理過(guò)的容器所制備的膠體金3次重復(fù)的波形幾乎重合，說(shuō)明該鍍劑處理使膠體金質(zhì)量更穩(wěn)定。

2.1.3 膠體金標(biāo)記抗體實(shí)驗(yàn)

膠體金標(biāo)記抗體預(yù)試驗(yàn)顯色情況見(jiàn)表1：當(dāng)抗體濃度為0.5～2.0 μg·mL-1時(shí)，Cip對(duì)T線(xiàn)上抗原與抗體反應(yīng)有強(qiáng)抑制作用；當(dāng)抗體濃度大于4.0 μg·mL-1時(shí)，無(wú)抑制作用；但抗體濃度小于1.0 μg·mL-1時(shí)，顯色偏淺。因此，以1 mL膠體金中加2.0 μg抗體進(jìn)行正式標(biāo)記。

圖1 膠體金紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描圖Fig.1 Scanogram of colloidal gold by UV- visible spectrophotometer

2.1.4 免疫膠體金試劑板檢出限

以2.5～100 ng·mL-1的Pef、Ofl、Nor和Lom標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試新制備的免疫膠體金試劑板(圖2)，可以看出，Pef的LOD為5.0 ng·mL-1，Ofl和Nor的LOD為2.5 ng·mL-1，Lom的LOD為2.0 ng·mL-1。

2.1.5 交叉反應(yīng)結(jié)果

試劑條與100 ng·mL-1氯霉素和1 mg·mL-1鏈霉素、四環(huán)素或磺胺嘧啶交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均呈陰性。

2.2 樣品預(yù)處理方法優(yōu)化

方法A吹干時(shí)間20～35 min，尤其是從最后1 mL吹至近干特別慢。方法B其實(shí)是在方法A的基礎(chǔ)上將溶劑吹至全干，以測(cè)試喹諾酮類(lèi)藥物在吹干后是否能穩(wěn)定；方法C吹干較快，只需5～8 min。4種樣品預(yù)處理方法的比較結(jié)果見(jiàn)表2∶A法檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定；B法出現(xiàn)較多假陰性結(jié)果，可能是因?yàn)榇蹈蓵r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，致使喹諾酮類(lèi)藥物損失較大；C法的檢測(cè)靈敏度和結(jié)果精密度均最好；D法操作最方便，但靈敏度低于C法和A法。

表1膠體金標(biāo)記抗體預(yù)試驗(yàn)顯色情況

Table1Color rendering of colloidal gold labelled antibody in preliminary experiment

抗體濃度Antibodyconcentration/(μg·mL-1)PBST線(xiàn)顯色ColorofTlineC線(xiàn)顯色ColorofClineCipT線(xiàn)顯色ColorofTlineC線(xiàn)顯色ColorofCline抑制Inhibition0.5*———S1.0**——**S2.0*****—***S3.0***********W4.0************—5.0************—

*，淺紅色；**，紅色；***，深紅色；S，強(qiáng)抑制作用；W，弱抑制作用；—，無(wú)色或無(wú)抑制作用。

*， Light red; **， Red; ***， Purple red; S， Strong inhibition; W， Weak inhibition; —， Colorless or no inhibition.

圖2 4種喹諾酮藥物免疫膠體金法檢出限Fig.2 LOD of immune colloidal gold detection for 4 QNs

因此，C法和D法分別適用于高靈敏度檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2.3 實(shí)際樣品對(duì)比檢測(cè)與驗(yàn)證

2.3.1 與HPLC對(duì)比結(jié)果

取10份HPLC檢測(cè)有Nor、Cip或Enr殘留的鱉、魚(yú)、小龍蝦和泥鰍樣品，免疫膠體金法檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性；有3份小龍蝦樣品HPLC檢出有環(huán)丙沙星殘留，免疫膠體金C法檢測(cè)呈陽(yáng)性；有26份HPLC未檢出Nor、Cip或Enr的樣品，免疫膠體金法呈陽(yáng)性。

2.3.2 不同預(yù)處理方法對(duì)比結(jié)果

取經(jīng)HPLC檢測(cè)Cip和Nor總殘留量為35 μg·kg-1的鱉樣品進(jìn)行不同預(yù)處理方法對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，從左到右分別為采用D法、組織滲出液直接滴板和C法進(jìn)行預(yù)處理后的檢測(cè)結(jié)果，均為陽(yáng)性，中間試劑板上血液引起背景顏色較深，均勻布滿(mǎn)整個(gè)觀察窗，但結(jié)果仍可辨識(shí)，說(shuō)明抗體未與樣品中雜質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，右側(cè)試劑條顯示的是經(jīng)過(guò)有機(jī)試劑提取和凈化的結(jié)果，更清晰，更干凈，檢測(cè)靈敏度也相對(duì)更高。

2.3.3 LC- MS/MS驗(yàn)證結(jié)果

表2不同樣品預(yù)處理方法的檢測(cè)結(jié)果

Table2Comparison of test results of four sample processing methods

標(biāo)準(zhǔn)品SampleSDC/(ng·g-1)ABCDNC0————————————————————————Cip2.0+++———+++———+—+———+++———10.0+++++——++++++++++++++++—+—+++++++++Nor2.5++————+++————++———+++———15.0++++—+—+++++++++++++++—++++++++++

NC，陰性對(duì)照；SDC，加標(biāo)濃度；—，陰性或未檢出；+，弱陽(yáng)性；++，中等陽(yáng)性；+++，強(qiáng)陽(yáng)性。下同。

NC， Negative control; SDC， Standard addition concentration; —， Negative or Non- detected;+， Weak positive;++， Moderate positive; +++， Strongly positive. The same as below.

圖3 不同預(yù)處理方法檢出效果對(duì)比Fig.3 Detection effect comparison of different processing methods

用LC- MS/MS方法對(duì)10個(gè)HPLC和GICT(C法)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的樣品、3個(gè)HPLC為陽(yáng)性而GICT為陰性的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)于QNs殘留量較高的樣品，3種方法的檢測(cè)結(jié)果基本一致。HPLC檢測(cè)結(jié)果中，小龍蝦中Cip易出現(xiàn)假陽(yáng)性，鱉中Nor也出現(xiàn)部分假陽(yáng)性結(jié)果，但GICT與LC- MS/MS檢測(cè)結(jié)果一致。

選取10個(gè)HPLC為陰性而GICT(C法)為陽(yáng)性的樣品，LC- MS/MS法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，其中：9個(gè)樣品含多種QNs，且均有Cip和Enr藥物被檢出(但含量均低于3 μg·kg-1，即在LC- MS/MS最低定量限以下)，未檢出Nor；有1個(gè)樣品未檢出12種QNs中的任何1種，但GICT法顯示陽(yáng)性，其中可能含有這12種以外的QNs。

表3同一樣品不同檢測(cè)方法的結(jié)果對(duì)比

Table3Comparison of test results of different detection methods

方法Method藥物Reagent殘留量Residue/(μg·kg-1)TS-1TS-2TS-3TS-4TS-5TS-6TS-7CA-1MiAPC-1PC-2PC-3PC-4HPLCNor84201824241327——————Cip571534211622——81771315Enr—————13—105118————合計(jì)Total14135185845424910511881771315LC-MS/MSFlu1————————————Nor307———————————Eno33————————————Cip5015—17—1218——————Pef195———————————Lom246———————————Dan29————————————Enr2074571271001155———Ofl174——————4———Mar134———————————Sar276———————————Dif155———————————合計(jì)Total28060422724251001159———GICTQNs++++++++++++++++++++———

TS，鱉；CA，鯽魚(yú)；MiA，泥鰍；PC，小龍蝦。下同。

TS，Trionyxsinensis; CA，Carassiusauratus; MiA，Misgurnusanguillicaudatus; PC，Procambarusclarki. The same as below.

表4HPLC陰性樣品的LC- MS/MS和GICT檢測(cè)結(jié)果

Table4Test results of HPLC negative samples by LC- MS/MS and GICT

方法Method藥物Reagent殘留量Residue/(μg·kg-1)TS-8TS-9TS-10TS-11MACA-2CCMPCIRNLC-MS/MSFlu3—534———4—Nor——————————Eno——<10——————<10Cip<3<3<3<3<3<3<3—<3<3Pef14—<3—6—————Lom———<3—15——<3—Dan—2——————<3—Enr<3<3<3<3<3<3<3—<3<3Ofl4——4——————Mar—4————————Sar——6<6————<6—Dif——<3<3<3———3—GICTQNs++++++++++++++++

MA，黃鱔； CC，鯉魚(yú)；MP，青魚(yú)；CI，草魚(yú)；RN，青蛙。

MA，Monopterusalbus; CC，Cyprinuscarpio; MP，Mylopharyngodonpiceus; CI，Ctenopharyngodonidellus; RN，Rananigromaculata.

3 結(jié)論與討論

本研究利用自制的雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)體外制備方法獲得的單克隆抗體，研制檢測(cè)水產(chǎn)品中QNs殘留的高靈敏度免疫膠體金試劑盒，對(duì)農(nóng)業(yè)部2292號(hào)公告中禁用的4種QNs藥物檢出限均≤5.0 μg·kg-1，與LC- MS/MS方法的符合性高，完全可滿(mǎn)足我國(guó)、美國(guó)和日本等國(guó)對(duì)水產(chǎn)品Q(chēng)Ns殘留快速檢測(cè)的需求。

實(shí)驗(yàn)中用HPLC法檢測(cè)小龍蝦樣品易出現(xiàn)Cip假陽(yáng)性，與3方面因素有關(guān)：(1)樣品基質(zhì)干擾；(2)樣品在預(yù)處理時(shí)濃縮了5倍，雖然可在一定程度上彌補(bǔ)方法靈敏度低的缺陷，但會(huì)帶來(lái)更嚴(yán)重的基質(zhì)干擾；(3)HPLC的檢出方法，不管是熒光法還是紫外法均為非特異性的方法。相對(duì)而言，GICT法和LC- MS/MS法的靈敏度和特異性均高于HPLC法。近幾年，在水產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)工作中，HPLC法逐步被LC- MS/MS法取代。

GICT法雖然是一種定性或半定量的檢測(cè)方法，但由于檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、成本低，符合市場(chǎng)準(zhǔn)入制度和基地準(zhǔn)出制度實(shí)施對(duì)檢測(cè)時(shí)效性的需求。本文中免疫膠體金試劑條具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，具體表現(xiàn)為：(1)與多種喹諾酮類(lèi)藥物反應(yīng)，而與其他類(lèi)別的藥物無(wú)交叉反應(yīng)；(2)在檢測(cè)過(guò)程中(D法)，抗體可以從未經(jīng)過(guò)任何預(yù)處理的樣品中識(shí)別出喹諾酮類(lèi)藥物而不受其他物質(zhì)干擾。綜合比較分析，免疫膠體金法非常適合于作為水產(chǎn)品中喹諾酮類(lèi)藥物殘留的快速篩查檢測(cè)方法進(jìn)行推廣。

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