不同方法提取海洋硅藻粗多糖的比較

陳利華，王 欣，成家楊

(北京大學(xué)深圳研究生院 環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 深圳 518055)

海洋微藻多糖是海洋微藻的生物活性物質(zhì)之一[1]，由多個(gè)相同或不同的單糖基通過(guò)糖苷鍵相連而形成的高分子碳水化合物組成，是微藻體中最重要的組成成分之一[2]。微藻多糖約占藻體干質(zhì)量的20%～70%，是一類混合物，總體分為三類：最外層細(xì)胞壁多糖、細(xì)胞壁多糖間的粘多糖、細(xì)胞內(nèi)的貯藏多糖。微藻多糖除了具有工業(yè)價(jià)值外，還具有多種生物活性及藥用功能[3]。目前，關(guān)于海洋藻多糖的研究遠(yuǎn)不及陸地植物和大型藻類多[4-9]。海洋硅藻作為海洋浮游生物的主要類群(類數(shù)和生物量一般占80%以上)，具有種類多、繁殖快、分布廣等特點(diǎn)，是海洋硅藻多糖的主要來(lái)源之一[10]。

目前，大多數(shù)研究以海洋硅藻為對(duì)象開(kāi)展了硅藻多糖抗腫瘤、抗病毒、抗輻射和提高免疫力等活性方面的研究，包括羽紋藻、舟形藻等[11-14]，而對(duì)于硅藻多糖的提取方法研究較少。硅藻粗多糖可為后續(xù)的活性研究提供原料來(lái)源，是硅藻多糖研究的一個(gè)重要方面[15-18]。已報(bào)道的海洋硅藻多糖提取過(guò)程主要包括：冷水或熱水提取、稀酸、稀堿或稀鹽溶液提取[19-21]，添加有機(jī)沉淀劑(如乙醇等)，離心去除蛋白及殘?jiān)詈笥美鋬龈稍锓ǐ@得粗多糖[22]。隨著對(duì)提取工藝的不斷改進(jìn)，出現(xiàn)了一些新的提取工藝，包括酶輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取及加壓液體萃取等方法[23]，超聲波法可以使硅藻干粉在浸取過(guò)程中更好地溶解出多糖，此外，還可以利用凍融破碎法[24]。這些方法常被用作提取前預(yù)處理，但是利用上述提取方法得到的物質(zhì)為粗多糖，含有較多的雜質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)和少量的無(wú)機(jī)鹽，需要進(jìn)行進(jìn)一步提純[25]。盡管一些研究提出了有效的海洋微藻多糖提取方法，但多數(shù)研究是利用同一類提取方法，同時(shí)利用多種方法對(duì)同一微藻生物質(zhì)進(jìn)行多糖提取，并對(duì)其粗多糖提取率及總糖含量進(jìn)行比較的研究較少，這導(dǎo)致無(wú)法明確某一種或某一類微藻生物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的最佳粗多糖提取方法。不同種類微藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及成分存在差異，適用的粗多糖提取方法可能不同。因此，比較不同提取方法對(duì)同一類微藻生物質(zhì)粗多糖的提取效果具有重要意義。

本研究以室外培養(yǎng)的海洋硅藻干粉為材料，采用9種不同提取方法提取硅藻粗多糖(水提法、酸法、堿法、超聲法及凍融法等)?？疾炝瞬煌崛》椒ㄏ麓侄嗵堑奶崛÷始岸嗵强偺?、蛋白質(zhì)及硫酸基含量，以篩選出較佳的提取方法。然后利用篩選的方法從4種純種海洋硅藻中提取粗多糖，以篩選出適合提取多糖的硅藻藻種。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)用藻：(1)深圳大鵬新區(qū)海洋微藻培養(yǎng)基地露天培養(yǎng)獲得的海洋硅藻藻粉(約70%(細(xì)胞數(shù)比例)為角毛藻，其余30%由舟形藻、菱形藻、海鏈藻及繭形藻組成)；(2)4種純種硅藻分別為角毛藻、菱形藻、繭形藻、海鏈藻。

試劑：無(wú)水乙醇、氫氧化鈉(粒)、無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水葡萄糖、苯酚、硫酸鉀、氯化鋇、明膠、三氯乙酸、濃鹽酸、濃硫酸均為分析純。需要配制試劑：1 mol·L-1HCl、0.5%明膠、1%氯化鋇- 明膠、3%三氯乙酸。

試驗(yàn)儀器：電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG- 9140A)、電子分析天平(AL104/01)、離心機(jī)(Centrifuge5810R)、智能恒溫水浴鍋(SCG- 4)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、pH計(jì)(Startorius PB- 10)、臺(tái)式冷凍干燥機(jī)、紅外消化爐。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將混合海洋硅藻粉研磨過(guò)325目篩，得到均勻的硅藻粉，用于后續(xù)試驗(yàn)的藻粉來(lái)源。

1.2.2 海洋硅藻粗多糖提取方法

比較9種不同方法(水浸提法、稀酸提取法、稀堿提取法、超聲+凍融法、凍融+加熱法、超聲+凍融+加熱法、4% NaOH 、4% NaOH+凍融法與4% NaOH+凍融+加熱法)的粗多糖提取率，選出最佳的提取方法。在提純過(guò)程中采用乙醇分級(jí)沉淀法，考察同一方法下不同倍體積乙醇對(duì)粗多糖提取率的影響。每種方法使用的料液比均為1∶30 (質(zhì)量體積比)、提取時(shí)間為4 h。具體提取操作方法如下：

(1)水浸提取法[23]：提取溫度分別設(shè)定為50、60、70、80、90和100 ℃，藻水混合液在設(shè)定的溫度下加熱，在4 000g下離心20 min獲得上清液。

(2)稀酸提?。河?.1 mol·L-1HCl提取后離心獲得上清液。

(3)稀堿提?。河?.1 mol·L-1NaOH提取后離心獲得上清液。

(4)超聲+凍融法：對(duì)藻水混合液進(jìn)行超聲破碎90 min，反復(fù)凍融4次，離心取上清液。

(5)凍融+90 ℃：對(duì)藻水混合液進(jìn)行超聲破碎90 min后反復(fù)凍融4次，置于水浴鍋中90 ℃恒溫水浴加熱4 h，4 000g離心20 min，分別收集上清液和沉淀。沉淀中繼續(xù)加入等體積去離子水，90 ℃恒溫水浴加熱2 h，4 000g離心20 min，收集上清液。將2次得到的上清液混合。

(6)超聲+凍融+90 ℃：將藻水混合液超聲破碎90 min后反復(fù)凍融4次，90 ℃恒溫水浴加熱4 h，4 000g離心20 min，收集上清液。

(7)4% NaOH法：將硅藻干粉按一定比例置于4% NaOH溶液中，使其充分反應(yīng)，4 000g離心20 min得到上清液。

(8)4% NaOH+凍融法：將硅藻干粉置于4% NaOH溶液中，使其充分反應(yīng)，反復(fù)凍融4次，4 000g離心20 min得到上清液。

(9)4% NaOH+凍融+90 ℃法：將硅藻干粉按一定比例置于4% NaOH溶液中，反復(fù)凍融4次，4 000g離心20 min，分別收集上清液與藻渣；然后將藻渣置于沸水浴中加熱3 h，離心得到上清液。

分別將上述方法得到的上清液加熱濃縮至原體積的1/4以去除溶液中的蛋白質(zhì)，然后冷卻至室溫。分別用0.4、1、2、3、4和5倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀提純。將得到的沉淀物置于凍干機(jī)中干燥，得到粗多糖干粉。

1.2.3 粗多糖提取率計(jì)算方法

粗多糖提取率為提取得到的粗多糖干粉質(zhì)量(g)相對(duì)硅藻干粉質(zhì)量(g)的百分比，即：

粗多糖提取率=m粗多糖/m硅藻× 100%。

1.2.4 粗多糖組成成分分析方法

總糖含量測(cè)定[24]：采用硫酸- 苯酚法測(cè)定樣品的總糖含量，配制0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于15 mL刻度試管，準(zhǔn)確加蒸餾水至2.0 mL，分別加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸，用渦旋混合器混合均勻，于沸水浴加熱5 min，取出后室溫下冷卻15 min，分別在480、490 nm測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及換算因子計(jì)算樣品總糖含量。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用凱氏定氮法測(cè)定粗多糖中的蛋白質(zhì)含量，將粗多糖樣品與濃硫酸和催化劑(K2SO4、CuSO4·5H2O)一同加入消解管內(nèi)加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。將消化液轉(zhuǎn)入凱氏定氮反應(yīng)器內(nèi)，用0.1 mol·L-1鹽酸吸收后再用已經(jīng)標(biāo)定過(guò)的NaOH溶液進(jìn)行滴定。

硫酸鋇比濁法測(cè)定硅藻多糖中硫酸基含量[25]：將硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)樣品108.75 mg K2SO4溶于100 mL 1 mol·L-1HCl中，即得到0.6 mg·mL-1硫酸基標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取多糖樣品10 mg，加入5mL 1 mol·L-1HCl中，于110 ℃加熱水解8 h，冷卻后，8 000g，離心20 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法：首先準(zhǔn)確吸取預(yù)先配制好的硫酸基標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.04、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2 mL于消解管中，加鹽酸至0.2 mL；以0.2 mL 1 mol·L-1HCl溶液作為空白。然后加入三氯乙酸3.8 mL及氯化鋇- 明膠1.0 mL，振蕩搖勻，室溫靜置15 min，于360 nm測(cè)吸光度D1；以1.0 mL明膠溶液代替氯化鋇溶液，相同方法測(cè)吸光度D2；以硫酸基毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為吸光度(D1-D2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中樣品提取及測(cè)定均設(shè)置2個(gè)平行樣。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Orgin 8.6、SPSS11.5軟件進(jìn)行樣本方差、樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異顯著以P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法的粗多糖提取率

2.1.1 水提法

如圖1所示，水提法的粗多糖提取率比較低，均低于4.3%。同一溫度下，隨著乙醇體積的增加，粗多糖的提取率呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.05)，但當(dāng)提取溫度達(dá)到100 ℃，各處理差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明乙醇體積是影響多糖提取率重要因素之一，各種多糖在不同濃度的乙醇中具有不同的溶解度，隨著乙醇體積的增大，逐級(jí)沉淀出分子量由大到小的多糖類物質(zhì)；但溫度高時(shí)，這種作用不明顯。相同乙醇體積下，溫度不同，提取率亦不同，但兩者間無(wú)明顯正相關(guān)或負(fù)相關(guān)規(guī)律(P>0.05)，表明醇沉體積對(duì)粗多糖提取的影響比溫度更大?？傮w來(lái)說(shuō)，水提法粗多糖提取效率不高，原因可能是硅藻細(xì)胞壁為納米硅質(zhì)結(jié)構(gòu)，不易被破壞[25-27]，藻體細(xì)胞內(nèi)含有藻膽蛋白、高度不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì)，長(zhǎng)時(shí)間的加熱會(huì)導(dǎo)致這些有效成分的破壞，所以水提法不利于藻體細(xì)胞的綜合利用。

2.1.2 其他物理化學(xué)方法

對(duì)比圖1和圖2可以看出，稀酸法或稀堿法提取的粗多糖總量均明顯高于水提法，這可能是由于稀酸和稀堿法破壞了硅藻的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，溶解出胞內(nèi)的多糖、纖維素、半纖維素等物質(zhì)，這些多糖類物質(zhì)可能更易溶于酸性或是堿性溶劑，從而增加了多糖的產(chǎn)量[22]。稀酸法的粗多糖提取率隨著乙醇體積的增加大致呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在乙醇體積為4倍時(shí)，粗多糖提取率達(dá)到最大，而稀堿法的粗多糖提取率隨乙醇體積的增加變化不顯著。同時(shí)，3種物理提取法(超聲+凍融、凍融+90 ℃、超聲+凍融+90 ℃)的多糖提取率隨乙醇體積的增加變化不明顯，最高提取率分別為5.58%、3.99%、5.23%，略高于水提法，表明超聲、凍融操作對(duì)多糖提取具有一定程度的促進(jìn)作用。

相同乙醇體積下，不同柱子上無(wú)相同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)，無(wú)相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。At the same ethanol volumes， data on the bars marked without the same uppercase letter indicated significant differences at P<0.01， data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖1 不同溫度下水提法的多糖提取率Fig.1 Extraction rate of polysaccharide by water extraction at different temperatures

在濃堿(4% NaOH)法中，多糖提取率隨乙醇體積的增加，呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，在乙醇體積為3倍時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大(28.44%)；濃堿+凍融法中，乙醇體積為3倍時(shí)多糖提取率達(dá)到最大(33.14%)；濃堿+凍融+90 ℃法中，乙醇體積增加到2倍時(shí)，多糖提取率顯著增加，乙醇體積為3倍時(shí)提取率達(dá)到最大(44.40%)。在濃堿的基礎(chǔ)上同時(shí)使用凍融或加熱的物理方法，如濃堿+凍融、濃堿+凍融+90 ℃，用3倍體積乙醇沉淀，多糖提取率最高，表明4% NaOH提取之后輔助凍融法可提高粗多糖的提取率。這是因?yàn)閮鋈谶^(guò)程促使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，增加了細(xì)胞的親水功能；同時(shí)，冷凍可促使細(xì)胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰粒，引起細(xì)胞膨脹破裂，之后的加熱則進(jìn)一步破壞硅藻細(xì)胞壁的納米硅質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而提高了提取率[20-21]。

在以往的一些研究中，雖然對(duì)比了同一方法下不同提取條件(溫度、pH等)對(duì)粗多糖提取的影響，但僅僅對(duì)同一醇沉體積下得到的多糖結(jié)果進(jìn)行對(duì)比[10，13-14]。本實(shí)驗(yàn)考察了不同方法中不同醇沉體積獲得的粗多糖提取率，能更充分反映不同方法對(duì)粗多糖提取率的影響。

2.2 粗多糖成分

以上結(jié)果表明，不同提取方法的硅藻粗多糖提取率存在差異，推測(cè)不同方法提取的粗多糖成分亦可能存在差異，單以多糖提取率為指標(biāo)衡量提取方法的優(yōu)劣較片面。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)不同粗多糖的總糖、蛋白質(zhì)和硫酸基含量進(jìn)行了分析。

2.2.1 總糖含量

將提取出的粗多糖分別配制成0.1 mg·mL-1樣品溶液，按照1.2.4節(jié)硫酸- 苯酚測(cè)定方法測(cè)定其總糖含量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，分別在490、480 nm下繪制總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖3)，所得的線性回歸方程分別為：y=7.533x-0.099(R2=0.996)，y=7.614 3x-0.135(R2=0.999 8)。

1，稀酸法(0.1 mol·L-1 HCl pH=3)；2，稀堿法(0.1 mol·L-1 NaOH pH=10)；3，超聲+凍融；4，凍融+90 ℃；5，超聲+凍融+90 ℃；6，濃堿(4% NaOH)；7，濃堿(4% NaOH)+凍融；8，濃堿(4% NaOH)+凍融+90 ℃。圖4、圖5、圖6、圖7同。1， Acid extraction (0.1 mol·L-1 HCl pH=3); 2， Alkali extraction (0.1 mol·L-1 NaOH pH=10); 3， Ultrasonic+freeze thawing; 4， Freeze thawing+90 ℃; 5， Ultrasonic+freeze thawing+90 ℃; 6， Concentrated alkaline (4% NaOH); 7， Concentrated alkaline(4% NaOH)+freeze thawing; 8， Concentrated alkaline(4% NaOH)+freeze thawing+90 ℃. the same as Fig.4， 5，6 and 7.圖2 不同提取方法的多糖提取率Fig.2 Extraction rate of polysaccharide by different methods

A，490 nm總糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；B，480 nm總糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；C，硫酸基含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線A， Standard curve of total sugar content under 490 nm; B， Standard curve of total sugar content under 480 nm; C， Standard curve of sulfate group圖3 總糖含量和硫酸基含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of total sugar content and sulfate group content

相同波長(zhǎng)下，柱狀圖上無(wú)相同小寫(xiě)字母的表示各處理間差異顯著(P<0.05)，無(wú)相同大寫(xiě)字母的表示各處理間差異極顯著(P<0.01)At the same wave length， data on the bars marked without the same uppercase letter indicated significant differences at P<0.01， data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.圖4 不同提取方法所得多糖的總糖含量Fig.4 Contents of total sugar in polysaccharide extracted by different methods

試驗(yàn)測(cè)得的水提法得到粗多糖樣品總糖含量為4%～5%，其他8種方法粗多糖樣品的總糖含量測(cè)定結(jié)果如圖4所示?？傮w來(lái)看，每種方法提取出的硅藻粗多糖中戊糖及糖醛酸均高于己糖含量(硫酸- 苯酚法中，己糖在490 nm有最大吸收，戊糖及糖醛酸在480 nm有最大吸收)。凍融+90 ℃法提取的粗多糖總糖含量最高，為33.62%(480 nm)和28.06%(490 nm)。不同方法的粗多糖總糖含量大小為：凍融+90 ℃>濃堿+凍融法>超聲+凍融+90 ℃>超聲+凍融>稀堿法(pH=10)>濃堿+凍融+90 ℃>濃堿法(4% NaOH)>稀酸法(pH=3)，這與粗多糖提取率大小順序不同。盡管凍融+90 ℃及超聲+凍融+90 ℃的粗多糖提取率最低(圖2)，但其粗多糖的總糖含量高于其他方法，表明添加額外的化學(xué)試劑會(huì)一定程度上降低粗多糖的純度。酸性條件下，粗多糖的總糖含量最低，這是由于酸性條件下某些多糖(糖苷鍵)發(fā)生降解或破壞；堿性條件下，粗多糖中的雜質(zhì)較多，使純度下降；相比之下，濃堿法+凍融方法提取的粗多糖卻保持了較高的多糖含量。這有可能是由于凍融促進(jìn)了硅藻胞內(nèi)多糖的溶出，彌補(bǔ)了堿液的負(fù)作用，間接提高了粗多糖中的多糖含量。

2.2.2 蛋白質(zhì)含量

凱氏定氮法測(cè)定結(jié)果表明，本研究中硅藻干粉中蛋白質(zhì)含量為14.40%，說(shuō)明硅藻干粉中含有一定量的蛋白質(zhì)。水提法得到的粗多糖樣品中蛋白質(zhì)含量為0.8%左右，其他方法提取的粗多糖樣品中蛋白質(zhì)含量為3.89%～8.58%，大小為超聲+凍融>凍融+90 ℃>超聲+凍融+90 ℃>濃堿+凍融法>稀堿法(pH=10)>濃堿+凍融+90 ℃>稀堿法(pH=10)>稀酸法(pH=3)>濃堿法(4% NaOH)(圖5)。

2.2.3 硫酸基含量

硫酸多糖(sulfated polysaccharide)為多糖的硫酸化衍生物，是多糖分子鏈中單糖分子的部分羥基被硫酸基取代而形成的一類多功能活性物質(zhì)[3]。研究表明，硫酸多糖的許多生物活性功能除與多糖結(jié)構(gòu)、水溶性、分子量等有關(guān)外，與硫酸基含量(糖基所帶硫酸基的個(gè)數(shù))亦有著直接聯(lián)系[28-31]?；诖耍狙芯靠疾炝瞬煌崛》椒ㄋ么侄嗵侵辛蛩峄暮?。

用干燥至恒質(zhì)量的K2SO4配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到的線性回歸方程為y=3.0175x-0.0024(R2=0.999 1)(圖3- C)。不同提取方法所得粗多糖中硫酸基的含量如圖6所示。水提法得到的粗多糖樣品中硫酸基含量為0.03%～0.11%，稀酸法(pH=3)、稀堿法(pH=10)、超聲+凍融、凍融+90 ℃、超聲+凍融+90 ℃、濃堿法、濃堿+凍融法、濃堿+凍融+90 ℃法提取的粗多糖中硫酸基含量分別為6.58%、1.65%、3.55%、3.94%、2.86%、0.97%、3.23%和1.90%，表明稀酸條件下多糖中的硫酸基不易受破壞，而堿性條件則會(huì)造成硫酸基的流失，這是由于堿性條件下硫酸基容易生成3， 6- 內(nèi)醚衍生物或發(fā)生Walden轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致硫酸基脫落[28]。凍融及加熱操作可彌補(bǔ)堿法對(duì)硫酸基的負(fù)作用，使硫酸基含量保持較高水平。

2.3 不同提取方法下單位質(zhì)量硅藻的多糖組分

本研究中水提法得到的粗多糖樣品的總糖、蛋白質(zhì)、硫酸基含量相對(duì)較低，以下只對(duì)其余8種方法得到粗多糖樣品進(jìn)行比較。綜合粗多糖提取率與單位質(zhì)量粗多糖的成分結(jié)果，計(jì)算出單位質(zhì)量藻粉提取的物質(zhì)組成成分，結(jié)果如圖7所示?？傮w來(lái)看，堿法條件下單位質(zhì)量藻粉獲得的總糖量較高，是其他方法的5～10倍，濃堿法+凍融法所得的總糖量最高。不同提取方法單位質(zhì)質(zhì)量藻粉獲得的總糖量大小為濃堿+凍融法>

濃堿+凍融+90 ℃>濃堿法(4% NaOH)>稀酸法(pH=3)>超聲+凍融+90 ℃>稀堿法(pH=10)>超聲+凍融>凍融+90 ℃。盡管堿提法的粗多糖總糖含量總體較低，但粗多糖的提取率明顯高于其他方法，獲得的總糖總量更高。同樣，雖然凍融加熱法等物理方法的單位粗多糖總糖含量較高，但由于其粗多糖提取率明顯低于酸提法或堿提法，導(dǎo)致單位硅藻干粉中提取的總糖含量較低。蛋白質(zhì)含量與多糖量呈相似趨勢(shì)，不同提取方法單位質(zhì)量藻粉獲得的硫酸基含量大小為濃堿+凍融法>濃堿+凍融+90 ℃>稀酸法(HCl，pH=3)>濃堿法(4% NaOH)>超聲+凍融>稀堿法(NaOH，pH=10)≈凍融+90 ℃≈超聲+凍融+90 ℃。這些結(jié)果表明，濃堿+凍融法從單位質(zhì)量硅藻干粉中提取出的總糖和硫酸基含量較高，優(yōu)于其他方法。

在劉筱瀟等[14]的研究中，僅從不同提取條件對(duì)粗多糖提取率的影響篩選出3種硅藻多糖適宜的提取方法，未對(duì)每種粗多糖樣品的多糖含量進(jìn)行測(cè)定。戴軍等[10]以粗多糖的多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了杜氏鹽藻多糖的提取工藝，未將粗多糖提取率考慮在內(nèi)。微藻生物質(zhì)多糖的最終得率與粗多糖得率、粗多糖中的多糖含量相關(guān)。因此，相比于以往的一些研究，本研究結(jié)果能準(zhǔn)確地反映不同提取方法的優(yōu)劣。

2.4 純種硅藻粗多糖的提取

采用篩選出的濃堿+凍融法對(duì)4種純種硅藻粉(角毛藻、菱形藻、繭形藻、海鏈藻)進(jìn)行粗多糖提取，醇沉體積為3倍。提取結(jié)果如圖8- A所示，角毛藻、菱形藻、繭形藻、海鏈藻的粗多糖提取率分別為38.28%、26.39%、62.06%、13.79%。

A，多糖提取率；B，粗多糖組分；C，單位質(zhì)量生物質(zhì)(藻粉)的粗多糖組分。A， Extraction rate of polysaccharide; B， Components of crude polysaccharide; C， Components of per unit diatom biomass (dry powder).圖8 不同硅藻的多糖提取效果比較Fig.8 Comparison of polysaccharides extraction effects from different marine diatom species

同時(shí)測(cè)定了粗多糖的總糖含量(480、490 nm)和硫酸基含量。結(jié)果(圖8- B)顯示，4種純種硅藻的總糖含量均在30%左右，硫酸基含量順序?yàn)榻敲?海鏈藻>菱形藻>繭形藻，表明這4種硅藻的粗多糖純度相當(dāng)，但硫酸基含量存在明顯差異。結(jié)合粗多糖提取率及粗多糖組分含量，計(jì)算出單位質(zhì)量硅藻生物質(zhì)提取的總糖含量為繭形藻(約24%)>角毛藻>菱形藻>海鏈藻(約5%)；硫酸基含量順序?yàn)榻敲?5.05%)>菱形藻>海鏈藻>繭形藻(0.51%)(圖8- C)。雖然繭形藻的粗多糖總糖與其他3種藻相當(dāng)，但由于其提取率較高，提取出的總糖含量也明顯高于其他3種藻粉，表明繭形藻適用于硅藻多糖提取，而角毛藻則適用于硫酸基多糖的提取和開(kāi)發(fā)。

3 結(jié)論

水提法的粗多糖提取率最低，均低于4.3%，其中總糖含量為4%～5%，蛋白質(zhì)含量為0.8%，硫酸基含量為0.03%～0.11%，其他8種方法中，濃堿法粗多糖提取率最高。除水提法之外，其他8種提取方法中，與物理法(超聲/凍融/加熱)相比，化學(xué)試劑法(添加酸與堿)均能一定程度降低單位質(zhì)量粗多糖的總糖含量；粗多糖中蛋白質(zhì)含量均較低，總體變化趨勢(shì)與總糖含量相似；而硫酸基含量以稀酸法最高，堿法最低。單位質(zhì)量硅藻干粉的總糖含量以濃堿+凍融法最高，凍融+90 ℃法最低。濃堿+凍融法提取的單位硅藻干粉總糖含量為10.49%(480 nm)和9.04%(490 nm)，蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量為2.14%，硫酸基含量為1.07%。4種純種硅藻(角毛藻、菱形藻、繭形藻、海鏈藻)中，從繭形藻提取的粗多糖總糖含量最高，為23.96%(480 nm)和24.79%(490 nm)；從角毛藻提取的粗多糖硫酸基含量最高，為5.05%。

[1] 高亞輝， 梁君榮， 陳長(zhǎng)平， 等. 海洋硅藻多樣性與生態(tài)作用研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2011， 50(2): 455-464.

GAO Y H， LIANG J R， CHEN C P， et al. Studies on biodiversity and ecological importance of marine diatoms[J].JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)， 2011， 50(2): 455-464. (in Chinese with English abstract)

[2] 孫惠潔. 紅毛藻多糖的提取純化及其性質(zhì)的研究[D].廈門: 集美大學(xué)， 2008.

SUN H J. Extraction， purification and characterization of ploysaccharides fromBangiafusco-purpurea[D]. Xiamen: Jimei University， 2008. (in Chinese with English abstract)

[3] HAYSAHI K， HAYASAHI T， KOJIMA I. A natural sulfated polysaccharide， calium spirulan， isolation fromSpirulinaplatensis:invitroandinvivoevaluation of anti- herps simp lex virus and anti- human immunodeficiency virus activities[J].AIDSResearchHumanRetroviruses， 1996， 12(15): 1463-1471.

[4] 陳姣， 徐繼林， 李艷， 等. 3種海洋硅藻不同培養(yǎng)階段揮發(fā)性成分的比較分析[J]. 海洋學(xué)報(bào)， 2014， 36(8): 49-64.

CHEN J， XU J L， LI Y， et al. Analysis of volatile components from three marine diatoms at different growth stages[J].ActaOceanologiaSinica， 2014， 36(8): 49-64. (in Chinese with English abstract)

[5] 王大志， 黃世玉， 程兆第. 三種海洋硅藻胞外多聚物形態(tài)、微細(xì)結(jié)構(gòu)及組成的初步研究[J]. 海洋與湖沼， 2004， 35(3): 273-278.

WANG D Z， HUANG S Y， CHENG Z D. Morphology， fine structure and chemical composition of extracellular polymeric substances in three marine diatom species[J].OceanologiaetLimnologiaSinica， 2004， 35(3): 273-278. (in Chinese with English abstract)

[6] 金德祥. 海洋硅藻學(xué)[M]. 廈門: 廈門大學(xué)出版社， 1991: 70-78.

[7] 高亞輝. 海洋微藻分類生態(tài)及生物活性物質(zhì)研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2001， 40(2): 566-573.

GAO Y H. Studies on taxonomy， ecology and bioactive products of marine microalgae[J].JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)， 2001， 40(2): 566-573. (in Chinese with English abstract)

[8] ARMBRUST E V. The life of diatoms in the world′s oceans[J].Nature， 2009， 459: 185-192.

[9] HOAGLAND K D， ROSOWSKI J R， GRETZ M R， et al. Diatom extracellular polymeric substances: Function， fine structure， chemistry， and physiology[J].JournalofPhycology， 1993， 29(5): 537-566.

[10] 戴軍， 王旻， 尹鴻萍， 等. 杜氏鹽藻多糖提取工藝的優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2007， 33(3): 123-127.

DAI J， WANG M， YIN H P， et al. Optimization of extraction technique of polysaccharides fromDuanaliellasalina[J].FoodandFermentationIndustries， 2007， 33(3): 123-127. (in Chinese with English abstract)

[11] 王長(zhǎng)海， 溫少紅， 鞠寶. 紫球藻多糖的提取和測(cè)定[J]. 中國(guó)海洋藥物， 1999 (1): 22-25.

WANG C H， WEN S H， JU B. Abstraction and measurement of polysaccharides inPorphyridiumcruentum[J].ChineseJournalofMarineDrugs， 1999 (1): 22-25. (in Chinese with English abstract)

[12] 張新宇， 王雷， 李光友， 等. 綠色巴夫藻硒多糖的提取、分離與純化[J]. 海洋與湖沼， 2000， 31(6): 643-646.

ZHANG X Y， WANG L， LI G Y， et al. Extraction， isolation， and purification of selenium polysaccharides inPavlovavirdis[J].OceanologiaetLimnologiaSinica， 2000， 31(6): 643-646. (in Chinese with English abstract)

[13] 徐錫蓮， 童微星， 雷引林， 等. 鹽藻胞外多糖分離純化方法研究[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2007， 26(4): 28-33.

XU X L， TONG W X， LEI Y L， et al. Separation and purification of extracellular polysaccharides fromDunaliellasalina[J].JournalofFoodScienceandBiotechnology， 2007， 26(4): 28-33. (in Chinese with English abstract)

[14] 劉筱瀟， 孫穎穎， 管習(xí)超， 等. 3種海洋微藻多糖提取工藝的研究[J]. 海洋通報(bào)， 2010， 29(5): 534-539.

LIU X X， SUN Y Y， GUAN X C， et al. Study on the extraction process of polysaccharide from three species of marine microalgae[J].MarineScienceBulletin， 2010， 29(5): 534-539. (in Chinese with English abstract)

[15] HELLEBUST J A. Extracellular products[M]//STEWART W D P. Algal physiology and biochemistry. Berkeley: University of California press， 1974: 838-863.

[16] FOGG G E. The ecological significance of extracellular products of phytoplankton photosynthesis[J].BotanicaMarina， 2009， 26(1): 3-14.

[17] POULET S A， MARTIN- JéZéQUEL V. Relationships between dissolved free amino acids， chemical composition and growth of the marine diatomChaetocerosdebile[J].MarineBiology， 1983， 77(1): 93-100.

[18] TOSHIMITSU HAYASHI A， HAYASHI K， MAEDA M， et al. Calcium spirulan， an inhibitor of enveloped virus replication， from blue- green algaSpirulinaplatensis[J].JournalofNaturalProducts， 1996， 59(59): 83-87.

[19] 鄭維發(fā)， 陳才法， 鮑康德， 等. 新月菱形藻胞外多糖的成分及其硫酸酯的制備[J]. 中草藥， 2005， 36(12): 1790-1793.

ZHENG W F， CHEN C F， BAO K D， et al. Components of exopolysaccharides ofNitzschiaclosteriumand preparation of their sulfated products[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs， 2005， 36(12): 1790-1793. (in Chinese with English abstract)

[20] 李亞清. 海洋微藻多糖的提取分離純化和結(jié)構(gòu)特征研究[D]. 大連: 大連理工大學(xué)， 2004.

LI Y Q. Extraction， purification and structural characteristics of polysaccharides from marine microalgae [D]. Dalian: Dalian University of Technology， 2004. (in Chinese with English abstract)

[21] 馮以明. 四種綠藻多糖的提取分離及其結(jié)構(gòu)與抗凝活性研究[D].青島 :中國(guó)海洋大學(xué)， 2012.

FENG Y M. Extraction， isolation， structure and anticoagulant activity of four green algae polysaccharides[D]. Qingdao: Ocean University of China， 2012. (in Chinese with English abstract)

[22] 周衛(wèi)松. 裙帶菜中巖藻黃質(zhì)、巖藻多糖的綜合提取純化研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué)， 2014: 34-36.

ZHOU W S. Study on purification of comprehensive extraction of fucoxanthin and fucoidan inUndariapinnatifida[D]. Hangzhou: Zhejiang University， 2014: 34-36. (in Chinese with English abstract)

[23] KADAM S U， TIWARI B K， O’DONNELL C P. Application of novel extraction technologies for bioactives from marine algae[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry， 2013， 61(20): 4667-4675.

[24] 歐陽(yáng)平凱， 胡永紅， 姚忠. 生物分離原理及技術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社， 2010: 170-178.

[25] 夏冰. 螺旋藻多糖提取純化方法研究[D]. 西安: 西安建筑科技大學(xué)， 2010.

XIA B. Study on extraction and purification of Polysaccharides fromSpirulinaplatensis[D]. Xi’an: Xi’an University of Architecture and Technology， 2010. (in Chinese with English abstract)

[26] 宮春宇， 潘迎捷. 硫酸鋇比濁法對(duì)龍須菜多糖中硫酸基含量的測(cè)定[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 2009 (B10): 402-405.

GONG C Y， PAN Y J. Determination of the content of sulfate group inGracilarialemaneiformispolysaccarides by barium sulfate turbidity[J].NaturalProductResearchandDevelopment， 2009 (B10): 402-405. (in Chinese with English abstract)

[27] 劉艷， 楊海波， 趙蓮華， 等. 扁藻多糖的分離分析及其生物活性的初步研究[J]. 生物技術(shù)， 2007， 17(2): 53-56.

LIU Y， YANG H B， ZHAO L H， et al. Separation and analysis of polysaccharide fromPlatymonassubcordigoramis(Will) Hanzen and primary studies on its’ anticancer activity[J].Biotechnology， 2007， 17(2): 53-56. (in Chinese with English abstract)

[28] GROTH T， WAGENKNECHT W. Anticoagulant potential of regioselective derivatized cellulose[J].Biomaterials， 2001， 22(20): 2719-2729.

[29] 鄧成華， 楊祥良， 王雁， 等. 取代度對(duì)硫酸酯化虎奶多糖抗氧化活性的影響[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2000， 28(5): 104-107.

DENG C H， YANG X L， WANG Y， et al. Effect of degree of substitution on the antioxidative activities of the sulfated Hunai polysaccharide[J].JournalofHuazhongUniversityOfence&Technology(NaturalScience)， 2000， 28(5): 104-107. (in Chinese with English abstract)

[30] MEI W Z， LIN L I， YUAN G S， et al. Review on structure- activity relationship of active polysaccharides[J].ModernChemicalIndustry， 2002， 22(8): 18-21， 23.

[31] 劉占峰， 孫漢文. 多糖的化學(xué)修飾研究進(jìn)展[J]. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2005， 25(1): 104-108.

LIU Z F， SUN H W. Progress of the research on chemically modifications of polysaccharide[J].JournalofHebeiUniversity(NaturalScience)， 2005， 25(1): 104-108. (in Chinese with English abstract)