鱘海豚鏈球菌的分離鑒定及其感染后的病理損傷

鄭李平，耿 毅，*，雷雪平，余澤輝，黃小麗，陳德芳，歐陽萍，曹師琪，韓 銳

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 溫江 611130；2.四川農業(yè)大學 水產系，四川 溫江 611130)

鱘魚是現(xiàn)存起源最早的脊椎動物之一，具有重要的學術研究價值和極高的經濟價值。近十幾年來，我國鱘魚產業(yè)取得了快速發(fā)展，形成了包括種業(yè)、繁育、養(yǎng)殖、加工和物流在內的產業(yè)技術體系和產業(yè)鏈，成為全球最大的養(yǎng)鱘國家[1]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖產量逐年增加，疾病已成為制約鱘魚養(yǎng)殖健康發(fā)展的重要因素之一。目前，細菌病是危害我國鱘魚養(yǎng)殖的主要疾病類型，已發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[2]、停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)[3]、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascarvia)[4]和海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[5]等病原菌。

海豚鏈球菌是引起水生動物疾病的一種重要病原，自1976年首次從患皮膚膿腫的亞馬遜淡水海豚(Iniageoffrensis)中分離到海豚鏈球菌以來[6]，此后相繼發(fā)現(xiàn)其在紅擬石首魚(Sciaenopsocellatus)、羅非魚(Oreochromisspp.)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、銀大麻哈魚(O.kisutch)、尖吻鱸(Latescalcarifer)、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)等多種魚類感染致病[7]。在我國已有紅擬石首魚[8]、羅非魚[9]、斑點叉尾鮰[10]等感染海豚鏈球菌，并導致嚴重經濟損失的報道。近年來，海豚鏈球菌對我國養(yǎng)殖鱘的危害逐漸顯露出來[5, 11-12]，并受到人們的關注。2016年6月，四川彭州養(yǎng)殖鱘魚流行一種臨床特征為神經癥狀和出血的傳染病，累計死亡率達35%以上，給鱘魚養(yǎng)殖造成嚴重的損害。本研究從自然發(fā)病鱘魚內臟中分離細菌，并對分離菌進行生理生化特性、16S rRNA序列分析和特異性PCR檢測，同時對病原菌進行了藥物敏感性測定及病理損傷觀察，旨在為該病的正確診斷及有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗魚與標準菌株

患病鱘魚，體質量125.8～536.4 g，由四川彭州某鱘魚養(yǎng)殖場送檢；健康鱘魚，體質量103.6～214.2 g，購于四川蒲江某鱘魚養(yǎng)殖場。海豚鏈球菌(S.iniae)標準菌株ATCC29178購于美國菌種保藏中心。

1.2 主要試劑

LB培養(yǎng)基、藥敏紙片(北京索萊寶科技有限公司)；腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)(北京欣經科生物技術有限公司)；細菌微量生化鑒定管[生工生物工程(上海)股份有限公司]；PCR Master Mix [擎科梓熙(成都)有限公司]；DL2000 DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒(成都百奧諾維生物科技有限公司)。

1.3 臨床癥狀與組織病理學觀察

對病魚的體表和內臟進行觀察，同時取患病鱘魚肝、腦、心、鰓、腎、脾和肌肉等組織于10%中性福爾馬林中固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并照相記錄。

1.4 病原菌的分離與形態(tài)觀察

無菌環(huán)境下，從瀕死鱘魚肝、腎和腦取樣，在BHI平板和LB平板上劃線接種，28 ℃培養(yǎng)36～48 h后觀察細菌生長情況，選取優(yōu)勢菌的單菌落再次劃線培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株。觀察菌落與細菌形態(tài)特征。

1.5 人工感染試驗

將獲得的優(yōu)勢純培養(yǎng)菌株(ZLP160615)接種于BHI肉湯，28 ℃搖床培養(yǎng)36 h，調整細菌濃度為1.6×108，1.6×107，1.6×106和1.6×105cfu·mL-1。健康鱘于28 ℃水溫暫養(yǎng)1周后，每尾腹腔注射0.2 mL，10尾1組。另選10尾魚每尾注射等量生理鹽水。接種后每天觀察鱘魚的臨床表現(xiàn)并統(tǒng)計發(fā)病死亡情況，連續(xù)觀察1周。對病死魚再次進行細菌的分離與特異性PCR檢測(方法參照1.7節(jié))。

1.6 生理生化鑒定及藥敏試驗

生理生化特性參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]進行測定；藥敏試驗采用紙片擴散法(KB法)，敏感度根據(jù)北京索萊寶科技有限公司提供的標準判定。

1.7 16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

取對數(shù)生長期的新鮮菌液，離心收集菌體，參照試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。采用16S rRNA 基因的通用引物[14](表1)。PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。PCR產物經DNA純化試劑盒純化后，送擎科梓熙(成都)有限公司測序。將測序所得16S rRNA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號，并與GenBank中已知核酸序列進行Blast比對。選擇與該序列同源性較高的16S rRNA基因序列，采用DNAstar進行多序列比對，MEGA6.0構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.8 S.iniae lctO 基因的PCR鑒定

參照Mata等[15]的方法，合成一對擴增S.iniaelctO(乳酸鹽氧化酶，lactate oxidase)基因的特異性引物(表1)。PCR反應條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增結果。

表1細菌16S rRNA和S.iniaelctO基因引物序列

Table1The primer sequence of bacterial 16S rRNA andS.iniaelctOgene

引物Primer引物序列Sequence(5'-3')目標條帶Productsize/bp16S-F16S-RlctO-FlctO-RAGAGTTTGATCCTGGCTCAGTACGGCTACCTTGTTACGACAAGGGGAAATCGCAAGTGCCATATCTGATTGGGCCGTCTAA1500870

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀與組織病理學觀察

病魚體表、胸鰭基部、口腔周圍出血(圖1- A)，部分魚體表出現(xiàn)潰瘍(圖1- B)；肛門紅腫，外突(圖1- C)。解剖見腹腔內積有淡黃色腹水；肝腫大發(fā)黃，彌散性出血，呈花斑狀，質地變脆(圖1- D)；脾、腎腫大，出血；腸道充血，腸壁變薄(圖1- E)；腦腫脹，腦膜淤血(圖1F)；鰓與其他組織未見明顯眼觀病變。

A，口腔周圍出血(箭頭)；B，體表出血，潰瘍灶(箭頭)；C，肛門紅腫，外突(箭頭)；D，肝腫大，彌散性出血(箭頭)；E，脾腫大，腸道充血，腸壁變薄(箭頭)；F，腦膜淤血(箭頭)A， Hemorrhage around the mouth (arrow); B， Hemorrhage on the body surface and skin ulcer (arrow); C， Anus swelling and evaginatus (arrow); D， Swelling and diffuse hemorrhage (arrow) in liver; E， Swelling in spleen， and congestion in intestine with thinned wall (arrow); F， Congestion in meninges (arrow)圖1 患病鱘魚的臨床特征Fig.1 Clinical signs of diseased sturgeon

組織病理學觀察到病魚肝血竇擴張淤血，出血，肝細胞腫脹，空泡變性，局部形成局灶性壞死，大量中性粒細胞與巨噬細胞浸潤(圖2- A)；并在一些肝血竇或細胞間見短鏈狀的球菌(圖2- B)。脾臟紅髓淤血，出血，白髓結構模糊，脾髓內淋巴細胞壞死，數(shù)量減少，炎癥細胞浸潤(圖2- C)。腎小管上皮細胞變性、壞死，管腔內見均質紅染的蛋白或脫落的上皮細胞形成的管型；腎間質出血，大量炎癥細胞浸潤(圖2- D)。腸道黏膜上皮細胞壞死脫落，碎片散落于腸腔；固有膜及黏膜下層淋巴細胞、巨噬細胞與中性白細胞浸潤(圖2- E)。骨骼肌纖維腫脹，橫紋消失，染色不均，甚至溶解、壞死、斷裂；肌纖維間隙增寬，炎癥細胞浸潤(圖2- F)。鰓小片上皮細胞腫脹；毛細血管擴張，充血(圖2- G)。心肌變性、出血，肌間隙大量中性粒細胞與單核細胞浸潤；心外膜疏松、增厚，大量炎癥細胞浸潤(圖2- H)。腦膜疏松，增厚，炎癥細胞浸潤；腦基質疏松，水腫，呈海綿狀，神經元細胞腫脹，固縮，小膠質細胞增生，出現(xiàn)噬神經元現(xiàn)象(圖2- I)。

2.2 病原菌的分離與形態(tài)特性觀察

從病魚肝臟分離到的優(yōu)勢菌ZLP160615在LB平板上生長不良，在BHI平板28 ℃培養(yǎng)36～48 h后，形成灰白色、不透明、表面光滑、邊緣整齊的針尖大小菌落。鏡檢觀察到成鏈狀或成雙排列的革蘭氏陽性球菌(圖3)。

2.3 人工感染試驗

注射菌液1.6×108、1.6×107cfu·mL-1濃度組鱘魚在接種感染第1天表現(xiàn)為游動緩慢無力，在水中無方向性竄游，鰭條基部和肛門出血；接種感染第2天開始出現(xiàn)死亡。1.6×106和1.6×105cfu·mL-1濃度組在接種感染第4天開始死亡。對照組鱘魚在觀察期內未見異常表現(xiàn)。試驗結束時，人工感染各組的死亡率分別為100%、90%、40%、20%。根據(jù)寇氏法計算得到分離株ZLP160615對鱘魚的LD50為6.3×105cfu·尾-1。對人工感染發(fā)病死亡的鱘魚再次進行細菌分離，獲得與分離菌株ZLP160615形態(tài)及理化特征一致的菌落，且特異性PCR檢測結果為陽性。

A，肝細胞腫脹，空泡變性；B，肝血竇或細胞間短鏈狀的球菌(箭頭)；C，脾臟淋巴細胞減少，炎癥細胞浸潤；D，腎小管上皮細胞變性、壞死，腎間質出血及炎癥細胞浸潤；E，腸粘膜上皮細胞壞死脫落；F，肌纖維腫脹，壞死，斷裂；G，鰓小片毛細血管淤血，上皮細胞腫脹；H，心肌變性，出血，心外膜增厚，大量炎癥細胞浸潤；I，腦膜增厚，炎癥細胞浸潤；腦水腫，神經元細胞腫脹，噬神經元現(xiàn)象(箭頭)。標尺=50μm。HE染色A， Vacuolar degeneration and swelling of hepatocytes; B， Chains and small clusters of streptococci showed in hepatic sinusoids or intercellular spaces (arrow); C， Lymphocytes depletion in the spleen， inflammatory cell infiltration; D， Degeneration and necrosis of renal tubular epithelial cells， hemorrhage appeared in renal interstitium and with inflammatory cell infiltration; E， Intestinal epithelial cells necrosis fall off; F， Skeletal muscle fibre swelling， fracture and necrosis; G， Branchial capillary congestion and epithelial cell swelling; H， Denaturation and hemorrhage appeared in myocardium， incrassation of epicardium showed in heart with inflammatory cells infiltration; I， Meningeal thickening with inflammatory cell infiltration; brain edema， neuronal cell swelling and neuronophagia (arrow). Bar=50 μm. HE stain圖2 感染海豚鏈球菌鱘魚的組織病理學損傷Fig.2 Pathohistological lesions of sturgeon infected by S. iniae

圖3 菌株ZLP160615的革蘭氏染色形態(tài)Fig.3 Micrograph of strain ZLP160615 in Gram staining

2.4 生理生化特征及藥敏試驗

分離菌ZLP160615的生理生化特征與S.iniae(ATCC29178)生理生化特性基本一致(表2)。藥敏結果顯示，分離菌ZLP160615對阿莫西林、慶大霉素、強力霉素、氟苯尼考等抗菌藥物高度敏感，對恩諾沙星、紅霉素等中度敏感，對四環(huán)素、新霉素不敏感(表3)。

2.5 16S rRNA 基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

分離菌ZLP160615的16S rRNA基因經PCR擴增后獲得大小約為1 500 bp的片段，與預期相符，提交NCBI獲得GenBank登錄號為KY930338。Blast比對結果顯示分離菌16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中S.iniae的同源性最高，達99%以上。在以分離菌16S rRNA序列和GenBank中S.iniae16Sr RNA序列及其他鏈球菌屬細菌16S rRNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上(圖4)，分離菌與S.iniae聚為一支。判斷分離菌ZLP160615為S.iniae。

表2分離株ZLP160615的生理生化特

Table2Biochemical and physiological characteristics of isolated strain ZLP160615

項目ItemsZLP160615S.iniae(ATCC29178)項目ItemsZLP160615S.iniae(ATCC29178)生長Growth10℃45℃6.5%NaCl8.0%NaCl水解Hydrolysis精氨酸Arginine七葉苷Esculin馬尿酸Hippurate氧化酶Oxidase+----+--+----+--過氧化氫酶Catalase產酸Acidfrom菊糖Inulin乳糖Lactose核糖Ribose棉籽糖Raffinose阿拉伯糖Arabinose甘露醇Mannitol山梨醇RorbitolV-P實驗V-Ptest------+--------+--

+，陽性反應；-，陰性反應。

+， Positive; -， Negative.

表3分離株ZLP160615的藥物敏感性

Table3Antibiotics sensitivities of the isolated strain ZLP160615

S，高度敏感；I，中度敏感；R，不敏感。

S， Highly sensitive; I， Moderately sensitive; R， Insensitivity.

圖4 基于分離株ZLP160615及相關菌株16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of isolate ZLP160615 and other related species in Streptococcus genus

2.6 S.iniae lctO 基因的PCR檢測

PCR技術擴增分離菌ZLP160615和S.iniaeATCC29178的lctO基因，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳獲得大小約為870 bp的片段(圖5)，與預期相符。結合生理生化鑒定、16S rRNA基因序列分析及特異性PCR檢測結果，鑒定分離菌ZLP160615為S.iniae。

M，DNA 分子質量標準；1，陰性對照；2，S. iniae陽性對照；3，ZLP160615M，DL 2 000 DNA marker; 1， Negative control; 2， Positive bacterial strain of S. iniae; 3， ZLP160615圖5 分離菌ZLP160615與S.iniae ATCC29178 lctO基因的PCR擴增產物電泳圖Fig.5 The electrophoresis of lctO gene PCR amplification of the isolate ZLP160615 and S. iniae(ATCC29178)

3 討論

自1957年從養(yǎng)殖虹鱒中首次發(fā)現(xiàn)鏈球菌病以來[16]，魚類鏈球菌感染已呈全球性分布，并給水產養(yǎng)殖造成嚴重影響。主要致病性鏈球菌有停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)、海豚鏈球菌(S.iniae)和無乳鏈球菌(S.agalactiae)等[17]，其中海豚鏈球菌具有最廣泛的宿主范圍，可感染海水、半咸水和淡水的多種養(yǎng)殖或野生魚類，其引起的疾病已嚴重危害水產養(yǎng)殖業(yè)，每年對水產養(yǎng)殖業(yè)造成的經濟損失超過100億美元[11]。近年來，我國不同養(yǎng)殖區(qū)域相繼有鱘魚海豚鏈球菌感染，并導致嚴重損失的報道[5, 11-12]，本研究也從四川彭州養(yǎng)殖鱘魚發(fā)生的以神經癥狀和出血為臨床特征的病魚體內分離到病原菌，通過表型與分子生物學特性鑒定其為海豚鏈球菌，這表明海豚鏈球菌對我國鱘魚養(yǎng)殖的危害日趨嚴重；而且海豚鏈球菌作為少數(shù)幾種人魚共患菌之一，對人也具有較強的致病力，有研究發(fā)現(xiàn)一些魚源的海豚鏈球菌分離株也能致人的感染[18]。因此，海豚鏈球菌不僅對我國鱘魚養(yǎng)殖造成危害，而且對人類健康也構成威脅，應予以高度關注。

對于S.iniae的鑒定，傳統(tǒng)的細菌鑒定方法如生理生化鑒定并不能準確鑒定海豚鏈球菌，且現(xiàn)有的鏈球菌生化鑒定試劑盒常常會將海豚鏈球菌鑒定為乳房鏈球菌(S.uberis)或停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)[19]。因此，本研究采用擴增分離菌16S rRNA基因序列并進行測序，測序結果顯示分離菌16S rRNA基因序列與S.iniae同源性最高，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與S.iniae聚為一支。結合形態(tài)特征，生理生化特性與分子生物學水平鑒定，確定了此次引起鱘魚發(fā)病的病原為海豚鏈球菌。此外，本研究還根據(jù)Mata等[15]設計的S.iniae一段具有較高保守性的序列l(wèi)ctO基因(乳酸鹽氧化酶基因)合成一對引物，進行特異性PCR檢測，最終得到預期片段870 bp，進一步確定分離菌為S.iniae。

本研究中發(fā)現(xiàn)鱘魚感染海豚鏈球菌主要表現(xiàn)為全身性多組織、器官變性、壞死和出血等敗血癥表現(xiàn)，這與海豚鏈球菌感染其他宿主所引起的臨床癥狀不盡相同，如在海豚上表現(xiàn)為皮膚膿腫[6]；在人類則常引起關節(jié)炎、蜂窩織炎，嚴重的還會導致心內膜炎、腦膜炎等[8]。鄧夢玲等[5]的研究中發(fā)現(xiàn)西伯利亞鱘感染海豚鏈球菌能引起其心臟外膜出現(xiàn)大量米粒樣大小的泡狀囊腫，但在本研究中并未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，這是與鱘魚的種屬特異性還是與病原菌的生物學特性有關還有待進一步的研究。

藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)，分離的海豚鏈球菌對阿莫西林、慶大霉素、強力霉素、氟苯尼考等抗菌藥物高度敏感，對恩諾沙星、紅霉素等中度敏感，對四環(huán)素、新霉素不敏感。這與鄧夢玲等[5]報道西伯利亞鱘源海豚鏈球菌對四環(huán)素高度敏感，陳言峰等[20]報道雜交鱧源海豚鏈球菌對新霉素、四環(huán)素等高度敏感的結果存在較大差異，這表明不同的海豚鏈球菌分離株在藥物敏感性上存在差異。因此，在針對由海豚鏈球菌引起魚類疾病的治療中，應在藥物敏感性檢測的基礎上，根據(jù)藥敏結果科學用藥，以提高治療的有效性，在本次海豚鏈球菌感染的病例中選用敏感的氟苯尼考則較好地控制了該病。但由于長期使用抗生素和化學藥物會使病原菌產生耐藥性，并且藥物殘留等現(xiàn)象不僅危害人類健康同時也對環(huán)境造成污染。因此，今后在魚類海豚鏈球菌病的防控中，應加強更為安全、環(huán)保的防控措施的研究與應用。目前，國內外已有學者開展了海豚鏈球菌滅活疫苗、減毒疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗等的研究[21]，如美國研制的一種海豚鏈球菌滅活苗，在以腹腔接種的方式免疫羅非魚后，相對保護率可達90%以上[22]；國內開展了羅非魚海豚鏈滅活疫苗[23]與牙鲆源海豚鏈球菌Sip11重組亞單位疫苗的研發(fā)[24]，這給魚類海豚鏈球菌病的免疫防控提供了可能。此外，也有研究表明黃連、黃芩、大黃，黃柏等中草藥對海豚鏈球菌有較強的抑菌和殺菌作用[25]，因此，中草藥防治魚類海豚鏈球菌的制劑也值得進一步開發(fā)，以控制海豚鏈球菌對水產養(yǎng)殖的危害。

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