烏鱧(Channa argus)源摩氏摩根菌(Morganella morganii)的分離、鑒定及藥敏特性

楊移斌，宋 懌，楊秋紅，劉永濤，楊先樂，艾曉輝，*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223； 2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100141； 3.上海海洋大學，上海 201306)

烏鱧(Channaargus)又名才魚、墨魚、烏魚、孝魚、生魚、蛇頭魚等，其分類地位為鱸形目(Perciformes)鱧科(Channidae)鱧屬(Channa)[1]。烏鱧是兇猛的肉食性經(jīng)濟魚類，適應(yīng)能力強，對各種不良環(huán)境具備較強耐受力，在我國分布區(qū)域廣泛，天然環(huán)境下生長的烏鱧很少發(fā)病[2]。烏鱧肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，而且具備去瘀生新、健脾利水、生肌補血及滋補調(diào)養(yǎng)等醫(yī)療功效[3]，因此獲得廣大消費者的喜愛，市場需求逐步擴大。為了滿足市場需求，烏鱧人工養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷提升，但因其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，集約化程度不斷提高，養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，導致病害頻發(fā)。目前，烏鱧養(yǎng)殖過程中主要疾病包括結(jié)節(jié)病[2，4-5]、潰爛病[6-7]、腹水病[8]、腐皮病[9]、出血病[10]等，這些病害的暴發(fā)，給養(yǎng)殖戶帶來了較大的經(jīng)濟損失，也嚴重制約了烏鱧養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

2016年5—6月江西南昌某養(yǎng)殖場暴發(fā)慢性傳染疾病，導致烏鱧批量死亡，死亡烏鱧主要癥狀為：烏鱧頭部及尾部有嚴重大塊潰爛，肛門紅腫外翻；解剖后發(fā)現(xiàn)腎、脾等充血，脾臟嚴重腫大，肝臟較脆易碎，顏色發(fā)黃，腸道發(fā)白，內(nèi)無食物。發(fā)病期持續(xù)近1個月，累計死亡率達20%，死亡魚體質(zhì)量大多為1.0～1.5 kg，造成較大經(jīng)濟損失。本研究從患病瀕死烏鱧體內(nèi)分離到一株優(yōu)勢菌，對其開展人工感染試驗、生理生化特性測定、16S rRNA序列分析及藥物敏感性等試驗，以期為烏鱧在養(yǎng)殖過程中暴發(fā)的細菌性疾病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試魚

發(fā)病烏鱧(1.0～1.5 kg)10尾采于江西南昌某烏鱧養(yǎng)殖場；健康烏鱧苗(50±2) g購自武漢某烏鱧繁殖場，烏鱧苗活力強、無傷病，暫養(yǎng)7 d無異常后用于試驗。

1.1.2 主要試劑

MH瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、革蘭氏染色液、藥敏紙片及細菌微量生化管均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR反應(yīng)體系、細菌基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；測序服務(wù)及引物合成均由武漢擎科生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離

取具有典型病癥，如體表潰爛及重要組織器官充血等(圖1)的烏鱧10尾，經(jīng)75%乙醇消毒后，在無菌操作臺內(nèi)取病魚肝腎脾、潰爛處肌肉，接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中18～24 h，挑取形態(tài)大小、顏色一致，以及優(yōu)勢度高的菌落進行細菌再純化，將分離純化得到的菌株與15%甘油混勻后保存于-80 ℃冰箱，分離菌株暫命名為JX15。

圖1 發(fā)病烏鱧Fig.1 Diseased Channa argus

1.2.2 人工感染及半致死劑量LD50測定

將JX15株劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，恒溫培養(yǎng)18 h后，用無菌生理鹽水洗下菌苔，并參照麥氏比濁法調(diào)整菌懸液濃度為4.9×109cfu·mL-1。

將健康烏鱧分為試驗組及對照組，每組均設(shè)置3個重復，每個重復30尾烏鱧。試驗期間連續(xù)充氧，水溫控制在22～25 ℃。試驗組烏鱧腹腔注射JX15株菌懸液0.1 mL·尾-1，對照組相同部位注射等量無菌生理鹽水。定時觀察烏鱧游動狀況，及時記錄發(fā)病死亡烏鱧數(shù)量及癥狀，并進行細菌再分離。

將分離菌株JX15用無菌生理鹽水稀釋成濃度為3.0×1010、3.0×109、3.0×108、3.0×107、3.0×106cfu·mL-1的菌懸液，分別注射到不同組的烏鱧體內(nèi)，注射量為0.1 mL·尾-1，即不同組每尾烏鱧注射JX15株的劑量分別為3.0×109、3.0×108、3.0×107、3.0×106、3.0×105cfu，而對照組相同部位注射等劑量無菌生理鹽水，每組烏鱧30尾。連續(xù)查看烏鱧游泳狀況，及時記錄發(fā)病死亡量，并用概率單位圖解法[11]計算半致死劑量(LD50)。

1.2.3 形態(tài)學及生理生化特性測定

將JX15菌株接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h后，觀察菌落大小、形態(tài)特征及其顏色，并進行革蘭氏染色及鏡檢。菌株JX15的理化特性采用細菌生化微量鑒定管[12]進行測定。

1.2.4 JX15株16S rRNA與gyrB基因測序

模板制備。將JX15株接種于普通營養(yǎng)肉湯中，置于搖床(200 r·min-1)恒溫28 ℃培養(yǎng)18 h，將JX15菌液離心后收集菌體，提取DNA作為PCR模板。

16S rRNA測序。上游引物為27F，5′- AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG- 3′，下游引物為1492R，5′- GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′。參照賴曉健等[13]方法進行PCR反應(yīng)擴增目的基因。PCR反應(yīng)產(chǎn)物送武漢擎科進行純化及序列測定。

gyrB測序。引物參照Yamamoto等[14]設(shè)計：UP1，5′- GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA- 3′；UP2，5′- AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT- 3′。PCR 反應(yīng)條件參照文獻[15]，PCR反應(yīng)產(chǎn)物送武漢擎科生物技術(shù)有限公司進行純化及測序。

系統(tǒng)發(fā)育分析。將分離純化菌株的16S rRNA及gryB基因與NCBI中已經(jīng)存儲的基因序列進行Blast比對，根據(jù)Blast比對結(jié)果，選取同源性較高的序列采用Clustal X軟件進行多序列匹配分析，通過MEGA 5.1軟件Neighbor- Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，1 000次Bootstrap檢驗置信度。

1.2.5 藥敏特性分析

JX15株的藥敏特性研究參照NCCLS抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準，采用紙片擴散法[16]。將JX15株接種于普通營養(yǎng)肉湯中，置于搖床(200 r·min-1)28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，用無菌生理鹽水稀釋成濃度為1.5×107cfu·mL-1的菌懸液，取150 μL菌液均勻涂于水解酪蛋白瓊脂平板上，貼上藥敏紙片，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量藥敏紙片的抑菌圈直徑。根據(jù)藥敏紙片廠家提供的抑菌圈直徑判斷標準進行判斷。

1.2.6 組織病理損傷觀察

取具有典型癥狀的烏鱧潰爛皮膚肌肉、肝臟、腎臟、脾臟及腸道，用10%的中性緩沖福爾馬林固定液固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片(厚度4 μm)，蘇木精- 伊紅(HE)染色，中性樹脂膠封片后，顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離和LD50測定

從自然發(fā)病瀕死烏鱧肝腎脾、肌肉潰爛處分離到同一株優(yōu)勢菌JX15。經(jīng)人工感染試驗，試驗組烏鱧出現(xiàn)死亡，15 d內(nèi)累計死亡達90%，而對照組試驗魚未出現(xiàn)任何異常。感染致死烏鱧出現(xiàn)體表輕微潰爛，肛門紅腫，有血水從肛門流出，肝、腎、脾嚴重充血等癥狀，與自然發(fā)病癥狀基本一致，并從感染死亡烏鱧體內(nèi)再分離到與菌株JX15一致的菌株，表明JX15株是烏鱧此次潰爛病的病原菌。建立試驗魚死亡率(%)與細菌劑量對數(shù)[lg(cfu)]的關(guān)系曲線：y=24x-123.52(圖2)，JX15株對烏鱧半數(shù)致死劑量LD50=3.4×105cfu·g-1。

2.2 細菌鑒定

JX15株在普通營養(yǎng)瓊脂上28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)大小為0.7～1.2 mm圓形、邊緣無缺刻、中央凸起、灰白色、表面光滑的菌落。鏡檢可見分離菌株JX15為革蘭氏陰性短桿菌。其理化特性見表1，由理化特性初步確定分離菌株JX15是摩氏摩根菌。將JX15的16S rRNA及gyrB基因序列與NCBI中存儲的序列進行Blast比對，結(jié)果顯示JX15株與摩氏摩根菌同源性最高，為99%。選取同源性較高的摩根菌屬序列及水產(chǎn)常見病原菌的16S rRNA及gyrB基因序列構(gòu)建系株是摩氏摩根菌(Morganellamorganii)。

圖2 烏鱧死亡率(%)與細菌劑量對數(shù) [lg(cfu)]的關(guān)系曲線Fig.2 Relation curve of Channa argus mortality with logarithm of bacterial dose

統(tǒng)發(fā)育樹(圖3、4)，結(jié)果顯示，JX15株與摩氏摩根菌聚為一簇。結(jié)合理化特性測定結(jié)果判定JX15

表1菌株JX15生理生化特征

Table1Physiologic and biochemical characteristics of strain JX15

試驗項目TestitemJX15M.morganii[12]試驗項目TestitemJX15M.morganii[12]運動性Motility++V-P--精氨酸雙水解酶Argininedihydrolase--乳糖Lactose--脲酶Urease++鼠李糖Rhamnose--檸檬酸鹽Citrate++蔗糖Sucrose--七葉苷Aesculin--木糖Xylose--H2S--阿拉伯糖Arabinose--明膠Gelatin--麥芽糖Maltose--氧化酶Oxidase--棉子糖Raffinose--硝酸鹽還原Nitratereductic++丙二酸鹽Malonicacidsalt--鳥氨酸脫羧酶Ornithinedecarboxylase++接觸酶Catalase++賴氨酸脫羧酶Lysinedecarboxylase--粘菌素Colistin++

+，陽性Positive；-，陰性Negative。

圖3 JX15株根據(jù)16S rDNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of JX15 strain based on 16S rDNA gene sequence

圖4 JX15株根據(jù)gyrB 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of JX15 strain based on gyrB gene sequence

2.3 藥敏特性

藥敏特性結(jié)果顯示：JX15株對氟苯尼考、諾氟沙星及頭孢噻肟等7種藥物高度敏感；對呋喃唑酮、氯霉素及卡那霉素等4種藥物中度敏感；對環(huán)丙沙星、苯唑西林及青霉素等11種藥物耐藥。具體見表2。

2.4 組織病理觀察

發(fā)病烏鱧潰爛處肌肉腫瘤細胞呈囊狀排列，腫瘤細胞大小均一，胞核異型性小，如圖5- A淡灰色箭頭所示；囊狀排列的腫瘤細胞之間充滿結(jié)締組織，如圖5- A灰色箭頭所示；組織中部分肌纖維萎縮，如圖5- A黑色箭頭所示。肝細胞胞質(zhì)廣泛呈空泡狀，如圖5- B淡灰色箭頭所示；部分肝竇輕度瘀血，如圖5- B灰色箭頭所示。脾臟白髓中血管擴張，充滿棕黃色顆粒物，如圖5- C黑色箭頭所示；組織中淋巴細胞數(shù)量豐富，紅白髓界限清晰，未見其他明顯異常，如圖5- C灰色箭頭所示。腸道組織中可見嗜堿性黏液，如圖5- D黑色箭頭所示；腸上皮局部杯狀細胞增生，如圖5- D淡灰色箭頭所示。腎臟組織中可見片狀出血灶，如圖5- E黑色箭頭所示；伴炎性細胞浸潤，如圖5- E灰色箭頭所示；部分腎小管上皮細胞腫脹，胞質(zhì)中可見空泡，如圖5- E淡灰色箭頭所示。

表2JX15株藥敏試驗結(jié)果

Table2Antibiotic sensitivity of strain JX15

藥物Drug抑菌圈直徑判斷標準Judgmentstandardofinhibitionzonediameter/mm耐藥Resistant中度敏感Mediumsensitivity高度敏感Highlysensitive藥物含量Dose/(μg·disc-1)抑菌圈直徑Inhibitionzonediameter/mm敏感性Sensitivity環(huán)丙沙星Ciflox≤15>15～21≥2150R苯唑西林Oxacillin≤10>10～13≥1310R青霉素Penicillin≤19>19～28≥2810U0R頭孢拉定Cefradine≤14>14～18≥18300R阿莫西林Amoxicillin≤13>13～18≥18200R呋喃唑酮Furazolidone≤14>14～17≥1730016I磺胺異噁唑Sulfisoxazole≤12>12～17≥173000R氯霉素Chloramphenicol≤12>12～18≥1830014I氟苯尼考Florfenicol≤12>12～18≥187522S克林霉素Clindamycin≤14>14～21≥2120R利福平Rifampicin≤16>16～20≥2050R諾氟沙星Norfloxacin≤12>12～17≥171026S頭孢噻肟Cefotaxime≤14>14～23≥233025S紅霉素Erythromycin≤13>13～23≥231512R新霉素Neomycin≤12>12～17≥173023S卡那霉素Kanamycin≤13>13～18≥183016I多西環(huán)素Doxycycline≤12>12～16≥163010R左氧氟沙星Levofloxacin≤13>12～17≥1750R鏈霉素Streptomycin≤11>12～15≥151014I妥布霉素Tobramycin≤12>12～15≥151020S慶大霉素Gentamicin≤12>12～15≥151019S阿米卡星Amikacin≤14>14～17≥173021S

S， 高度敏感； I，中度敏感；R， 耐藥。

S， Highly sensitive; I， Medium sensitivity; R， Resistant.

A，潰爛肌肉；B，肝臟；C，脾臟；D，腸道；E，腎臟。A， Ulcerated muscle; B， Liver; C， Spleen; D， Intestines; E， Kidney.圖5 肌肉和內(nèi)臟組織病理切片圖Fig.5 Pathological section of muscle and viscus tissues

3 討論

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)又稱摩根氏菌，1906年被Morgan首次發(fā)現(xiàn)，其隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)摩根菌屬(Morganella)。摩氏摩根菌在自然界分布廣泛，在水體、土壤及空氣中均有分布，但卻是可引起嚴重感染的條件致病菌之一。摩氏摩根菌毒力較強，能引起包括人在內(nèi)的多種動物死亡。感染致病癥狀主要有皮膚潰爛、肌肉出血、重要組織器官出血充血及腸道壞死等。目前已經(jīng)證實摩氏摩根菌可以引起人類多種感染性疾病，如敗血癥、關(guān)節(jié)炎及肺炎等[17-19]，是繼發(fā)感染重要病原菌，危害較大。同時研究者也從患肺炎袋鼠[20]、海貍鼠[21]、蛇[22]、病雞[23]，甚至雞蛋[24]中分離到摩氏摩根菌，表明摩氏摩根菌對陸生動物同樣具有很嚴重的危害，可能會通過垂直傳播途徑進一步擴散，更進一步影響食品安全，危害人類健康。摩氏摩根菌導致水生動物致病的報道更多，黎小正等[25]及蘭云等[26]均報道了黃喉擬水龜感染摩氏摩根菌死亡病例；陳永亮等[27]及孔蕾等[28]分別報道了摩氏摩根菌導致中華鱉腸道壞死病及類似癤瘡樣病癥；李瑞偉等[29]及李雪峰等[30]研究發(fā)現(xiàn)，摩氏摩根菌能引起大鯢及鱸魚體表出血；韓娜娜等[31]及王磊等[32]分別報道了摩氏摩根菌引發(fā)錦鯉及黑格爾七彩神仙魚體表潰爛等。本研究從患病烏鱧體內(nèi)分離到同一株優(yōu)勢菌JX15，經(jīng)回歸感染及鑒定，確定摩氏摩根菌為此次烏鱧發(fā)病的病原菌，對烏鱧的LD50為3.4×105cfu·g-1，顯示了較強毒力。關(guān)于摩氏摩根菌引起烏鱧致病報道尚屬首次。綜上可以得出，摩氏摩根菌致病對象范圍進一步擴大，危害性進一步增強，但其致病機制尚未完全明晰，因此深入研究摩氏摩根菌變得更加迫切。

隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展，分子生物手段在細菌鑒定中發(fā)揮的作用越來越大。16S rRNA是一個高度保守的基因序列，但在不同種屬間又具備一定的變異，因此可以很好地將細菌鑒定到屬甚至種，目前已經(jīng)成為細菌鑒定的重要工具[33]。但由于16S rRNA 基因序列在種內(nèi)鑒定有一定的局限性，為此，常在測完16S rRNA基因后再次測定進化相對較快的gryB等基因序列[34]，以使鑒定更加精準。本研究通過測定分離菌株JX15的16S rRNA及gyrB基因序列，分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，在進化樹上都可以明顯看到分離菌株JX15與摩氏摩根菌聚為一支，因此綜合理化特性可以準確判定分離菌株為摩氏摩根菌。

目前，水生動物細菌性病害防控仍然主要依靠藥物手段，但近年來，水生動物病原菌的耐藥性不斷增強，使得病害防控變得更加困難。摩氏摩根菌極易產(chǎn)生耐藥性，研究表明，其對氨基糖苷類、氯霉素類、β- 內(nèi)酰胺類都產(chǎn)生過耐藥[28]。本研究發(fā)現(xiàn)JX15株對氟苯尼考、諾氟沙星及頭孢噻肟等7種藥物高度敏感，對呋喃唑酮、氯霉素及卡那霉素等4種藥物中度敏感，對環(huán)丙沙星、苯唑西林及青霉素等11種藥物耐藥。其中對氟苯尼考等高度敏感與陳永亮等[27]研究一致。本研究結(jié)果可為烏鱧摩氏摩根菌病防控提供參考。

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