調(diào)控microRNAs修復(fù)糖尿病皮膚創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究

王曉梅　曹仁芳　馮海娟　曲建梅

[摘要] 目的 探究調(diào)控microRNAs修復(fù)糖尿病皮膚創(chuàng)面的治療效果。方法 隨機(jī)選取SPF級(jí)幼齡SD大鼠50只，按治療方法的不同分為兩組，對(duì)照組和研究組，每組25只。對(duì)研究組的大鼠在創(chuàng)緣周圍進(jìn)行三點(diǎn)注射pRcCMV-miR-21真核載體表達(dá)質(zhì)粒，而對(duì)對(duì)照組的大鼠在創(chuàng)緣周圍進(jìn)行三點(diǎn)注射pRc/CMV空白質(zhì)粒。兩組均使用鏈脲佐菌素對(duì)選取的大鼠進(jìn)行一次性腹腔注射法，建立糖尿病大鼠模型。在注射4周后，在大鼠背部進(jìn)行全層皮膚切除創(chuàng)面。術(shù)后進(jìn)行3 d后，對(duì)上述創(chuàng)面組織進(jìn)行切除。觀察兩組大鼠的創(chuàng)面愈合情況。結(jié)果 研究組在治療后7、14 d以及21 d后I型膠原光密度值要明顯高于對(duì)照組（P<0.05），研究組在治療后7、14 d以及21 d后纖維結(jié)合蛋白光密度值要明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論 正常大鼠的皮膚創(chuàng)面組織與糖尿病大鼠相比，其microRNAs存在明顯的差異，并且調(diào)控糖尿病大鼠的microRNAs對(duì)于皮膚創(chuàng)面具有一定的愈合作用，為日后的實(shí)驗(yàn)研究提供一定的理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 調(diào)控；microRNAs；修復(fù)；糖尿病皮膚創(chuàng)面

[中圖分類號(hào)] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-4062（2018）12（a）-0020-02

隨著社會(huì)以及經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們的生活模式發(fā)生了巨大的變化，社會(huì)老齡化嚴(yán)重，糖尿病的發(fā)病率不斷升高[1]。而糖尿病患者常常會(huì)發(fā)生糖尿病皮膚潰瘍等并發(fā)癥，該種并發(fā)癥與糖尿病患者的病情以及病程之間存在密切的聯(lián)系。在臨床上對(duì)于該種并發(fā)癥常常采用血管重建、清創(chuàng)術(shù)、控制感染以及減壓治療等常規(guī)治療[2]。但是臨床上常規(guī)治療的治療效果往往差強(qiáng)人意[3]。目前，研究表明適當(dāng)調(diào)控microRNAs能夠促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)面的修復(fù)，該文章就建立糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面模型來(lái)探究調(diào)控microRNAs修復(fù)糖尿病皮膚創(chuàng)面的治療效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取SPF級(jí)幼齡SD大鼠50只，日齡 35～40 d，平均體重（60.2±10.4）g，雌雄各半，將其隨機(jī)分為兩組，研究組和對(duì)照組，每組25只。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有大鼠在藥物處理前沒有其他的疾病，大鼠身體所有器官的機(jī)能均正常。一般資料，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

糖尿病大鼠模型的建立：將選取的大鼠正常喂養(yǎng)1周左右，隨后進(jìn)行禁水12 h，對(duì)其進(jìn)行100 mg/kg鏈脲佐菌素進(jìn)行腹腔注射，注射5 h后在進(jìn)行60 mg/kgSTZ的注射。72 h后對(duì)兩組大鼠進(jìn)行斷尾取血，使用血糖檢測(cè)儀對(duì)大鼠的血糖進(jìn)行檢測(cè)。若大鼠的血糖水平>16.7 mmol/ L，則模型建立成功[4]。隨后每周進(jìn)行1次檢測(cè)。次日對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，將其背部剔除毛發(fā)，進(jìn)行常規(guī)的消毒，使用手術(shù)剪刀于大鼠背部進(jìn)行1.0 cm×1.5 cm圓形創(chuàng)面的剪出。

治療方法：對(duì)研究組的大鼠在創(chuàng)緣周圍進(jìn)行三點(diǎn)注射pRcCMV-miR-21真核載體表達(dá)質(zhì)粒，而對(duì)對(duì)照組的大鼠在創(chuàng)緣周圍進(jìn)行三點(diǎn)注射pRc/CMV空白質(zhì)粒。每日對(duì)兩組大鼠進(jìn)行藥物注射，注射后使用無(wú)菌紗布對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行覆蓋，使用醫(yī)用膠帶進(jìn)行固定[5]。

標(biāo)本收集：研究組和對(duì)照組兩組大鼠進(jìn)行固定時(shí)間（治療后7、14 d以及21 d）的處死，同時(shí)取兩組1.0 cm×0.5 cm的創(chuàng)面基底組織，將其置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定。

創(chuàng)面組織中I型膠原光密度值以及纖維結(jié)合蛋白光密度值的檢測(cè)：使用免疫組化顯色法進(jìn)行檢測(cè)。首先將固定的創(chuàng)面基底組織使用常規(guī)石蠟包埋、切片，同時(shí)進(jìn)行FN免疫組織化學(xué)染色以及Ⅰ型膠原蛋白標(biāo)記并且封片。使用Leica Q550CW圖像分析和采集系統(tǒng)，每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行3張切片的觀察，在400倍顯微鏡下對(duì)每張切片選取5個(gè)不重疊的視野，對(duì)I型膠原光密度值以及纖維結(jié)合蛋白光密度值的平均值進(jìn)行測(cè)定[6]。

1.3 觀察指標(biāo)

在治療7、14 d以及21 d后，分別觀察并記錄研究組和對(duì)照組兩組大鼠的I型膠原光密度值以及纖維結(jié)合蛋白光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，其中計(jì)數(shù)進(jìn)行χ2（%）檢驗(yàn)，計(jì)量進(jìn)行t檢驗(yàn)， P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠在治療后不同時(shí)間內(nèi)I型膠原光密度值

研究組在治療后7、14 d以及21 d后I型膠原光密度值要明顯高于對(duì)照組（P<0.05），見表1。

2.2 兩組大鼠在治療不同時(shí)間纖維結(jié)合蛋白光密度值

研究組在治療后7、14 d以及21 d后纖維結(jié)合蛋白光密度值要明顯高于對(duì)照組（P<0.05），見表2。

3 討論

糖尿病皮膚潰瘍是屬于中醫(yī)中的“脫疽”“瘡瘍”[7]。中醫(yī)認(rèn)為糖尿病皮膚潰瘍是由于血行不暢，進(jìn)而造成皮膚內(nèi)營(yíng)養(yǎng)供給不足，或者是因?yàn)橥鈧哪Σ?，進(jìn)而造成皮肉的壞死。而西醫(yī)中認(rèn)為，糖尿病皮膚潰瘍的發(fā)生是由于局部高糖、神經(jīng)血管病變以及創(chuàng)面感染進(jìn)而造成創(chuàng)面的難以愈合。就相關(guān)研究資料表示，調(diào)控microRNAs能夠促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)面的愈合時(shí)間，進(jìn)而縮短的住院時(shí)間，進(jìn)而避免造成截肢。該文章就建立糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面模型來(lái)探究調(diào)控microRNAs修復(fù)糖尿病皮膚創(chuàng)面的治療效果。

MicroRNAs 是近些年來(lái)出現(xiàn)的一種非蛋白質(zhì)編碼 RNAs ，成熟的 microRNA 具有調(diào)節(jié)基因的表達(dá)活性的功能。據(jù)數(shù)據(jù)顯示， miRNA 的表達(dá)水平不僅在不同種類的腫瘤中是不相同的它們會(huì)在體內(nèi)起到抑癌基因和原癌基因的作用，而且其能夠促進(jìn)小鼠的愈合時(shí)間，促進(jìn)肉芽組織的生長(zhǎng)[8]。microRNAS可以通過(guò)和PTEN 的 3 - 非翻譯端結(jié)合， 與下調(diào) PTEN 蛋白表達(dá)，活化 Akt 通路可以用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞繼續(xù)存活，進(jìn)而產(chǎn)生順鉑的耐藥性。

構(gòu)成修復(fù)組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分為膠原，在愈合的初期，成纖維細(xì)大量的繁殖，隨后合并并被激活，分泌大量基質(zhì)成分以及膠原纖維。同時(shí)其與上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、周細(xì)胞以及新生毛細(xì)血管形成肉芽組織，進(jìn)而對(duì)皮膚創(chuàng)口組織進(jìn)行填補(bǔ)，促進(jìn)表皮細(xì)胞的愈合。在皮膚創(chuàng)面愈合的過(guò)程中，膠原的合成以及分泌以及沉積量主要是依靠成纖維細(xì)胞的數(shù)量增加而增加。就上文結(jié)果表明，研究組在治療后7、14 d以及21 d后I型膠原光密度值要明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。

纖維結(jié)合蛋白具有廣泛的生物學(xué)特性，其是一種大分子糖蛋白，其全程參與皮膚創(chuàng)面的愈合過(guò)程，纖維結(jié)合蛋白與膠原之間具有較強(qiáng)的親和力。纖維結(jié)合蛋白的主要作用為對(duì)細(xì)胞具有遷移作用以及化學(xué)趨化作用，能夠促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合速度，促進(jìn)肉芽組織的生成，進(jìn)而加快創(chuàng)面組織的愈合。纖維結(jié)合蛋白具有一定的調(diào)理作用，其作為細(xì)胞鋪展以及附著的介體，能夠在上皮化、細(xì)胞移行的過(guò)程中起到支持的作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的移動(dòng)，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)也有一定的維持作用。就上文數(shù)據(jù)顯示，研究組在治療后7、14 d以及21 d后纖維結(jié)合蛋白光密度值要明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。

綜上所述，正常大鼠的皮膚創(chuàng)面組織與糖尿病大鼠相比，其microRNAs存在明顯的差異，并且調(diào)控糖尿病大鼠的microRNAs對(duì)于皮膚創(chuàng)面具有一定的愈合作用，為日后的實(shí)驗(yàn)研究提供一定的理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 付穎， 吳南楠， 趙冬.內(nèi)脂素與MicroRNAs在心肌缺血模型大鼠心肌組織中的表達(dá)研究[J].中國(guó)糖尿病雜志， 2018， 26（3）：15-19.

[2] 李肖肖.miR-26a和miR-30c在調(diào)節(jié)TGFβ1誘導(dǎo)的糖尿病腎病上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的協(xié)同作用[J].中國(guó)病理生理雜志， 2017，22（5）：816.

[3] 黃宏， 邱偉， 朱明，等.蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白在糖尿病大鼠皮膚組織和創(chuàng)面組織中的表達(dá)研究[J].中華燒傷雜志， 2016， 32（10）：588-593.

[4] 劉風(fēng).自體富血小板凝膠治療糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面的機(jī)制及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)， 2017， 46（6）：848-850.

[5] 吳標(biāo)良， 唐乾利， 覃曉潔，等.基于MEBT/MEBO的ERK1/2和p38信號(hào)通路與糖尿病足免疫表達(dá)關(guān)系的研究[J].重慶醫(yī)學(xué)， 2016， 45（36）：5069-5071.

[6] 周日興， 李葉揚(yáng)， 李罡，等.整合素連接激酶信號(hào)通路在糖尿病大鼠皮膚病變及創(chuàng)面愈合中的作用[J].中華燒傷雜志， 2016， 32（4）：216-223.

[7] 林凱桑， 范麗君， 王思妤，等.溫敏水凝膠負(fù)載脂源性干細(xì)胞對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面血管新生影響的觀察[J].中國(guó)糖尿病雜志， 2017， 25（5）：449-453.

[8] 武姍， 劉洋， 朱旅云，等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β及其受體在糖尿病足創(chuàng)面愈合過(guò)程中作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)糖尿病雜志， 2017， 25（6）：569-572.

（收稿日期：2018-09-06）