人源CBX7全長(zhǎng)及部分片段的表達(dá)純化及單體結(jié)構(gòu)研究

呂縝一，陸昌瑞

（東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201600）

CBX7是存在于多梳蛋白家族（Polycomb group，PcG）中多梳抑制復(fù)合物1（Polycomb repressive complex 1，PRC1）上，對(duì)細(xì)胞的增殖及衰老起到調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄抑制因子[1]。人源CBX7蛋白位于人類染色體22q13.1上，由251個(gè)氨基酸組成，全長(zhǎng)約28.3 KDa[2]。其能直接參與PcG復(fù)合物對(duì)其他CBX蛋白家族編碼基因的轉(zhuǎn)錄抑制[3]，且和人類的多種癌癥和腫瘤的發(fā)生都有著一定聯(lián)系[4-5]。到目前為止，對(duì)人源CBX7蛋白結(jié)功能的研究報(bào)道并不多，對(duì)其結(jié)構(gòu)的研究?jī)H有兩篇報(bào)道[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)人源CBX7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，設(shè)計(jì)出相應(yīng)的片段進(jìn)行ppSUMO-CBX7/domain融合蛋白的構(gòu)建[8-10]，通過一系列純化方法得到蛋白單體，為CBX7蛋白結(jié)構(gòu)及功能的研究及PcG家族蛋白成員的研究奠定了基礎(chǔ)[11]。

1 材料與方法

1.1 材料

載體：pp-SUMO表達(dá)載體（含6個(gè)His標(biāo)簽）；菌種：DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞，CBX7 Template；試劑：K+、IPTG、各種酶及各種分析純等。

1.2 方法與步驟

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)測(cè)得到人源CBX7的二級(jí)結(jié)構(gòu)和該蛋白內(nèi)在無序分布圖，設(shè)計(jì)出了相應(yīng)的引物及需要表達(dá)的片段[8-10]，見表1。

表1 引物的設(shè)計(jì)

1.2.2 ppSUMO-CBX7/domain表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增后的CBX7/domain和SUMO質(zhì)粒一同用BamH1、Xhol1酶切；再將CBX7/domain與SUMO用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)中培養(yǎng)，挑取單克隆再次轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)保菌備用。

1.2.3 ppSUMO-CBX7/domain融合蛋白的表達(dá)及Ni柱親和純化

在37℃、225 r/min的條件下培養(yǎng)構(gòu)建好的工程菌，其OD600到0.6時(shí)，向培養(yǎng)基中加入適量IPTG誘導(dǎo)。取菌液經(jīng)4℃，3 500 r/min離心收集細(xì)胞，用 Ni-NTA Binding Buffer（500 mmol/L NaCl，pH值根據(jù)片段PI確定）重懸。用高壓細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后將懸液于4℃，12 000 r/min離心1 h。使上清與Ni結(jié)合；用Wash Buffer（設(shè)置Imidazole濃度梯度，500 mmol/L NaCl，pH值根據(jù)片段PI確定）洗脫；接著用Elution Buffer（250 mmol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl）洗脫目標(biāo)蛋白；最后 用 Strip Buffer（1mol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl）清洗 Ni柱。

1.2.4 ppSUMO-CBX7/domain離子交換純化

經(jīng)過Ni柱親和純化后，若存在和目標(biāo)蛋白分子量大小相近的雜蛋白，需要通過離子交換純化進(jìn)行再次純化。根據(jù)蛋白質(zhì)的PI選取Q_SP_FF Prepacked預(yù)裝柱，通過 Buffer A（50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA）柱平衡、進(jìn)樣、柱沖洗、Buffer A+Buffer B（50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl）梯度洗脫的程序設(shè)定純化蛋白。

1.2.5 ULP1酶切及酶切后Ni柱親和純化

將純化好的目標(biāo)蛋白加入10mL Buffer A+1 mmol/L DTT+5 μL ULP1酶的體系進(jìn)行酶切，切除SUMO載體和His標(biāo)簽。將酶切后的樣品再次用Ni柱純化，得到不含有殘基的CBX7/domain目標(biāo)蛋白[11]。

1.2.6 分子篩純化

使用GE公司Superdex 75 10/300 GL預(yù)裝柱，按照 Buffer A（50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl）柱平衡、上樣、洗脫的步驟進(jìn)行純化。

2 結(jié)果與討論

本次實(shí)驗(yàn)使用PCR、雙酶切、鏈接、轉(zhuǎn)化等方法，構(gòu)建了ppSUMO-CBX7（13-65aa）、ppSUMO-CBX7（51-151aa）和ppSUMO-CBX7（Full-Length）三個(gè)蛋白質(zhì)片段。

2.1 ppSUMO-CBX7/domain蛋白的表達(dá)及Ni柱親和純化條件

根據(jù)每個(gè)蛋白的自身性質(zhì)不同，改變誘導(dǎo)溫度及IPTG濃度對(duì)3個(gè)蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)條件的探索；根據(jù)每個(gè)蛋白的PI不同，對(duì)Ni柱親和純化時(shí)Buffer的PH值進(jìn)行探索[12-13]。確定ppSUMO-CBX7（13-65aa）的最適誘導(dǎo)溫度為37℃，IPTG濃度為1 mmol/L，Buffer的 pH值為7.5；ppSUMO-CBX7（51-151aa）的最適誘導(dǎo)溫度為18℃，IPTG濃度為0.5 mmol/L，Buffer的pH值無論是多少目標(biāo)蛋白都不可溶；ppSUMO-CBX7（Full-Length）的最適誘導(dǎo)溫度為18℃，IPTG濃度為1 mmol/L，Buffer的pH值為8.5。

隨后，根據(jù)融合蛋白對(duì)Imidazole的敏感度不同進(jìn)行了蛋白Ni柱親和純化Wash的Imidazole濃度探索，Imidazole濃度在20～80 mmol/L的范圍內(nèi)設(shè)置7個(gè)梯度。根據(jù)條件探索后發(fā)現(xiàn)：ppSUMO-CBX7（13-65aa）的Wash最適Imidazole為 20 mmol/L，ppSUMO-CBX7（Full-Length）的Wash最適Imidazole濃度為60 mmol/L。

選取每段融合蛋白的最適誘導(dǎo)條件及純化條件進(jìn)行親和純化，將純化結(jié)果用SDS-PAGE膠檢，得到圖1，該結(jié)果為Western Bolt所驗(yàn)證。

圖1 ppSUNO-CBX7全長(zhǎng)及片段的Ni柱親和純化SDS-PAGE膠檢

2.2 ppSUMO-CBX7/domain融合蛋白的離子交換純化

因?yàn)閜pSUMO-CBX7（13-65aa）的親和純化效果較好，可直接酶切，所以離子交換純化只針對(duì)ppSUMO-CBX7（Full-Length），經(jīng)過離子交換純化的SDS-PAGE膠檢如圖2所示。

圖2 ppSUNO-CBX7全長(zhǎng)的離子交換純化

2.3 ppSUMO-CBX7/domain融合蛋白的UPL1酶切及Ni柱親和純化

對(duì) ppSUMO-CBX7（13-65aa）、ppSUMOCBX7（Full-Length）進(jìn)行ULP1酶切，經(jīng)過SDSPAGE和SDS-Tricine PAGE膠檢得到單一目標(biāo)蛋白，如圖3所示。

圖3 ppSUMO-CBX7 ULP1酶切檢測(cè)

2.4 CBX7/domain 蛋白的分子篩純化

酶切后的樣品濃度達(dá)到2 mg/mL才適合做分子篩，而CBX7（Full-Length）濃度在1 mg/mL以下，所以只針對(duì)CBX7（13-65aa）做分子篩純化及SDS-Tricine PAGE膠檢，結(jié)果如圖4所示。

圖4 CBX7（13-65aa）蛋白的分子篩純化檢測(cè)

3 結(jié)論

CBX7蛋白在人類的多種腫瘤和癌癥中都有著重要的作用，但就目前而言對(duì)CBX7的研究無論是結(jié)構(gòu)還是功能的報(bào)道都很少。通過Psipred網(wǎng)站對(duì)人源CBX7蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道及預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)了引物。通過多種純化手段得到了較純的兩個(gè)單體蛋白以及得到已經(jīng)達(dá)到結(jié)晶濃度和純度的CBX7（13-65aa）單體蛋白。在純化不同的蛋白質(zhì)片段的過程中，發(fā)現(xiàn)即使所構(gòu)建的蛋白片段來自于人源CBX7蛋白，但每一段蛋白的性質(zhì)卻大不相同。誘導(dǎo)溫度時(shí)間的不同、Imidazole濃度的選擇、Buffer的pH值等對(duì)不同片段的純化有著很大影響。這些條件的探索結(jié)果為后續(xù)人源CBX7蛋白各片段及全長(zhǎng)的純化提供了重要的參考價(jià)值。

與此同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人源CBX7蛋白質(zhì)的中間區(qū)段存在大量不可溶性的蛋白質(zhì)，而這段區(qū)域的存在對(duì)CBX7蛋白的穩(wěn)定性有一定影響，凡是帶有這段區(qū)域的蛋白質(zhì)片段純化時(shí)都易發(fā)生降解或部分?jǐn)嗔训袈涞痊F(xiàn)象；并且如果單獨(dú)將這段區(qū)域構(gòu)建出來純化無法得到可溶性蛋白。由此，猜想人源CBX7蛋白質(zhì)可能是以C端和N端親水區(qū)域包裹著中間疏水區(qū)域的狀態(tài)存在于人體中的。目前人源CBX7蛋白的全長(zhǎng)還沒有純化到可以結(jié)晶的條件，但是對(duì)該蛋白純化的條件探索已基本完成，以上的猜想后續(xù)可通過結(jié)晶及X-ray晶體衍射來繼續(xù)驗(yàn)證。

[1]Ma R,Zhang Y,Sun T,et al.Epigenetic Regulation by Polycomb Group Complexes: Focus on Roles of CBX Proteins[J].Journal of Zhejiang Universityence B,2014,15(5):412-428.

[2]Qiang Li，Xiuhong Wang，Zheming Lu，et al.Polycomb CBX7 Directly Controls Trimethylation of Histone E3 at Lysine 9 at p16 Locus[J].Plos ONE,2010,5(10):e13732.

[3]Gil J,Bernard D,Martinez D.Polycomb CBX7 has a Unifying Role in Cellular Lifespan[J].Nat Cell Biol,2004,6(1):67-72.

[4]Steffen PA,Ringrose L.What are Memories Made of? How Polycomb and Trithorax Proteins Mediate Epigenetic Memory[J].Nature reviews Molecular cell biology,2014,15(5):340-356.

[5]Mozzetta C,Pontis J,Fritsch L,et al.The Histone H3 Lysine 9 Methyltransferases G9a and GLP Regulate Polycomb Repressive Complex 2-mediated gene silencing[J].Molecular cell,2014,53(2):277-289.

[6]Wang R,Taylor AB.Polycomb Group Targeting through Different Binding Partners of RING1B C-terminal Domain[J].Structure,2010:966-975.

[7]Simhadri C,Daze KD.Chromodomain Antagonists that Target the Polycomb-group Methyllysine Reader Protein Chromobox Homolog 7(CBX7)[J].Journal of Medicinal Chemistry,2014,57(7):2874-2883.

[8]Rost B,Yachdav G,Liu J.The PredictProtein Server[J].Nucleic Acid Res,2004,31(13):3300.

[9]Rost B,Fariselli P,Casadio R.Topology Prediction for Helical Transmembrane Proteins at 86% Accuracy[J].Protein Sci,1996,5(8):1704.

[10]Ceroni A,Passerini A,Vullo A,et al.DISULFIND: a Disulfide Bonding State and Cysteine Connectivity Prediction Server [J].Nucleic Acids Res.2006,34:177-181.

[11]Mossessova E,Lima CD.Ulp1-SUMO Crystal Structure and Genetic Analysis Reveal Conserved Interactions and a Regulatory Element Essential for Cell Growth in Yeast[J].Mol Cell,2000,5(5):865-876.

[12]Muller J,Verrijzer P.Biochemical Mechanisms of Gene Regulation by Polycomb Group Protein Complexes[J].Curr Opin Genet Dev,2009,19(2):150-158.

[13]Wotton D,Merrill J.C.Pc2 and SUMOylation[J].Biochem Soc Trans,2007,35(Pt6):1401-1404.