哈茨木霉和黑曲霉粗酶液預(yù)處理改善秸稈產(chǎn)甲烷性能

趙肖玲，鄭澤慧，蔡亞凡，趙宇賓，羅 凱，崔宗均，王小芬

0 引 言

近年來(lái)，全球天然氣的使用量持續(xù)增長(zhǎng)，中國(guó)作為推動(dòng)全球天然氣需求增長(zhǎng)的主要國(guó)家，到2030年左右將比歐盟和中東地區(qū)消耗更多的天然氣[1]。沼氣發(fā)酵工藝已在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于解決環(huán)境、農(nóng)業(yè)和能源問(wèn)題，產(chǎn)生了巨大的生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。農(nóng)林廢棄物等生物質(zhì)通過(guò)厭氧消化生產(chǎn)沼氣，作為一種可再生能源經(jīng)過(guò)凈化提純，將CH4濃度提升至96%以上，可升級(jí)為生物甲烷，注入天然氣管網(wǎng)或用作車(chē)輛燃料，擴(kuò)大其利用范圍，從而減少與化石燃料相關(guān)的溫室氣體的凈排放量[2-3]。據(jù)資源統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年至少應(yīng)有（3 000～4 000）×108m3的有機(jī)廢棄物可供用于生產(chǎn)生物天然氣，其中，可用于生產(chǎn)沼氣的農(nóng)業(yè)廢棄物約1×108t[4]。

玉米秸稈是中國(guó)主要的木質(zhì)纖維素廢棄物，每年產(chǎn)生約2.5億t，是厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣的潛在原料[5-6]。在玉米秸稈發(fā)酵過(guò)程中，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理和隨后的水解是關(guān)鍵過(guò)程，水解被認(rèn)為是有效厭氧發(fā)酵的速率限制步驟[7-9]。秸稈富含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，三者在秸稈中相互纏繞，構(gòu)成致密的空間結(jié)構(gòu)，不易被微生物及酶直接利用，因此，在厭氧發(fā)酵之前需要進(jìn)行預(yù)處理。

應(yīng)用最廣泛的預(yù)處理方法有物理預(yù)處理、化學(xué)預(yù)處理和生物預(yù)處理以及這些方法的組合[10-12]。物理方法如研磨、球磨、蒸汽爆破和超聲已經(jīng)在研究中得到了廣泛的關(guān)注[13]?；瘜W(xué)方法包括強(qiáng)堿如氫氧化鈉、氧化鈣和過(guò)氧化物的堿性預(yù)處理，以及酸性（如硫酸、乙酸和硝酸）預(yù)處理[14-15]。但由于物理預(yù)處理和化學(xué)預(yù)處理存在能耗高、設(shè)備要求嚴(yán)格、污染環(huán)境等問(wèn)題，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。生物預(yù)處理以其能源需求低、反應(yīng)條件溫和、不污染環(huán)境等優(yōu)勢(shì)，備受研究者青睞，因此，微生物和酶已經(jīng)成為許多學(xué)者研究的課題[16,7]。

分解纖維素的微生物如哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、球孢白僵菌（Colletotrichum gloeosporioides）和木霉屬（Trichoderma sp.）等[17]可以通過(guò)分泌纖維素酶和半纖維素酶來(lái)水解木質(zhì)纖維素材料。目前研究集中在纖維素酶或半纖維素酶對(duì)具有高纖維含量的底物厭氧發(fā)酵的影響，得到了有利的結(jié)果。Qui?ones等[18]研究了酶在不同原料連續(xù)生物甲烷化過(guò)程中的應(yīng)用，水解酶能夠?qū)⒄託猱a(chǎn)量和甲烷體積分?jǐn)?shù)分別提高10%～15%和5%～10%。同樣，Karray等[19]采用酶法（黑曲霉）預(yù)處理枸杞，還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到 7.3 g/L，沼氣產(chǎn)量比未經(jīng)處理的高出33.01%。因此，酶預(yù)處理在厭氧發(fā)酵中是有利的。然而，酶的高成本限制了現(xiàn)有商業(yè)酶在沼氣發(fā)酵中的應(yīng)用，故而低成本酶在廢棄物的厭氧發(fā)酵中的應(yīng)用將是十分重要的。農(nóng)業(yè)廢棄物可以作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基通過(guò)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶以降低酶的生產(chǎn)成本，這一路徑為酶的低成本生產(chǎn)提供了技術(shù)保障。可供利用的底物包括小麥秸稈、玉米秸稈、甘蔗渣等木質(zhì)纖維素材料[20-21]。

因此，低成本酶在玉米秸稈厭氧發(fā)酵中的預(yù)處理效果為本研究的重點(diǎn)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中堿度、VFA、sCOD的相互關(guān)系進(jìn)行了研究，以及對(duì)酶作為外源添加劑對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)中微生物的菌群結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了探討，以期為提高木質(zhì)纖維素原料沼氣轉(zhuǎn)化效率提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 哈茨木霉和黑曲霉的培養(yǎng)

試驗(yàn)所用的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)（KY644130）和黑曲霉(Aspergillus sp.)（KY644131）為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)工程研究中心篩選所得。擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為玉米秸稈粉培養(yǎng)基（玉米秸稈粉 10 g，(NH4)4SO44 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1 g，瓊脂 20 g，去離子水 1 000 mL，pH 值 6.5），在 30 ℃培養(yǎng)3 d后制備孢子懸浮液，用于制備粗酶液的接種物。通過(guò) CFU計(jì)數(shù)評(píng)估，菌懸液中活的孢子濃度為 2×109CFU/mL。

1.2 粗酶液的制備

產(chǎn)酶培養(yǎng)基為玉米秸稈粉-麥麩培養(yǎng)基（玉米秸稈粉：麥麩：營(yíng)養(yǎng)液=2∶1∶6；其中營(yíng)養(yǎng)液為(NH4)2SO42 g/L，MgSO45 g/L；KH2PO48 g/L；pH值自然），該培養(yǎng)基選用玉米秸稈和麥麩等農(nóng)業(yè)廢棄物作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基的主要組成成分，在 25 ℃恒溫培養(yǎng) 3 d，之后以固液比 1∶12的比例添加滅菌去離子水，在180 r/min搖床上浸提1 h，過(guò)濾離心后得到粗酶液。粗酶液具有水解纖維素和半纖維素的能力，其中哈茨木霉提取的酶T中CMCase酶活和木聚糖酶活分別為（12.38±0.69）和（230.53±23.03）U/mL，黑曲霉提取的酶A中CMCase酶活和木聚糖酶活分別為（3.32±0.68）和（891.77±27.36）U/mL，其中 1個(gè)酶活單位定義為1 h內(nèi)形成1 mg還原糖所需要的酶量。

1.3 原料和接種物

產(chǎn)酶培養(yǎng)基所用的青綠玉米秸稈及厭氧發(fā)酵所用的干黃玉米秸稈均取自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站（北京市海淀區(qū)），用切碎機(jī)切碎至5～8 cm的小段，于105 ℃烘箱中干燥20 min，之后在80 ℃下干燥至含水率低于10%。最后，用研磨機(jī)研磨，得到玉米秸稈粉。

接種污泥取自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州試驗(yàn)站連續(xù)運(yùn)行的以玉米秸稈和豬糞為原料的沼氣發(fā)酵罐。原料的基本性質(zhì)如表1。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 預(yù)處理

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理組，處理1為添加酶T的預(yù)處理組，用酶T（Enzyme T）表示；處理2為添加酶A的預(yù)處理組，用酶A (Enzyme A)表示；以未加酶的預(yù)處理作為對(duì)照組，用CK表示。將50 mL粗酶液（酶T和酶A）分別加入裝有 9 g干黃玉米秸稈粉的1 L藍(lán)蓋瓶中，在50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)處理 6 d，對(duì)照組將粗酶液換為50 mL去離子水。

表1 原料與接種污泥的基本性質(zhì)Table 1 Characteristics of raw materials and inoculum

1.4.2 厭氧消化

玉米秸稈經(jīng)6 d的預(yù)處理，從恒溫培養(yǎng)箱中取出，加入 300 mL接種污泥，添加去離子水補(bǔ)至發(fā)酵體積400 mL。發(fā)酵裝置填充氮?dú)猓圃靺捬醐h(huán)境。發(fā)酵溫度為（35±2）℃，每個(gè)處理 3個(gè)重復(fù)，空白組為只添加接種污泥的反應(yīng)器。每天攪拌一次，發(fā)酵周期為20 d。

每天測(cè)量沼氣產(chǎn)量和沼氣中甲烷含量，定期取樣測(cè)定反應(yīng)體系的pH值、揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）、可溶性化學(xué)需氧量（soluble chemical oxygen demand，sCOD）和堿度等指標(biāo)，取厭氧發(fā)酵24 h的樣品測(cè)定微生物群落結(jié)構(gòu)，以檢測(cè)酶作為外源添加劑對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落的影響。

1.4.3 指標(biāo)測(cè)定

使用美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)方法[22]測(cè)量玉米秸稈及接種污泥的總固體（total solid，TS）、揮發(fā)性固體（volatile solid，VS）、干物質(zhì)（dry matter，DM）、總碳（total carbon，TC）和總氮（total nitrogen，TN）。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素使用 Ankom 2000纖維分析儀（Ankom Technology Corp.，F(xiàn)airport，NY，USA）測(cè)定[23]。

將樣品在12000 r/min離心，樣品pH值的測(cè)定使用日本 Horiba公司的 B-212型微量 pH計(jì)。粗酶液中的CMCase、木聚糖酶活（xylanase）使用DNS法測(cè)定[24]。VFA使用日本島津LC-20A高效液相色譜儀測(cè)定[12]。sCOD使用COD快速檢測(cè)儀（Lovibond E799718，德國(guó)）[16]測(cè)定。堿度的測(cè)定使用滴定法[25]。

Illumina Miseq測(cè)序和數(shù)據(jù)分析：

為了檢測(cè)酶預(yù)處理對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物的沖擊，選用厭氧發(fā)酵24 h的樣品測(cè)定細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)。高通量（Illumina Miseq）測(cè)序由Majorbio有限公司（中國(guó)上海）進(jìn)行。使用細(xì)菌通用引物 338F和 806R（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和GGACTACHVGGGTWTCTAAT）和古菌通用引物524F和958R（TGYCAGCCGCCGCGGTAA和YCCGGCGTTGAVTCCAATT）擴(kuò)增V3-V4區(qū)，使用Illumina Miseq對(duì)擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。由 Majorbio有限公司（中國(guó)上海）提供的 www.isanger.com對(duì)微生物門(mén)和屬級(jí)進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析。

使用BMP-Test系統(tǒng)（WAL-BMP-Testsystem 3150，WAL，德國(guó)）測(cè)定每日產(chǎn)沼氣量，精度為0.1%。用該儀器測(cè)定反應(yīng)器中頂部空間的壓力 ΔP，使用公式（1）計(jì)算日產(chǎn)沼氣量[26]：

其中Vbiogas為日產(chǎn)沼氣體積，mL；ΔP為反應(yīng)器中壓力與大氣壓的絕對(duì)壓力差，kPa；Vheadspace為反應(yīng)器頂部空間的體積，mL；C為摩爾體積，273.15 K時(shí)為22.41 L/mol，101.325 kPa；R為通用氣體常數(shù)，8.314 L kPa/(K?mol)；T為絕對(duì)溫度，K。

使用配備有導(dǎo)熱性檢測(cè)器的氣相色譜儀（GC-2014，Shimadzu，Japan）測(cè)定沼氣中甲烷含量[12]。

日產(chǎn)甲烷量使用公式（2）計(jì)算：

式中Vmethane為日產(chǎn)甲烷體積，mL/g；Vbiogas為日產(chǎn)沼氣體積，mL；4CHφ為日產(chǎn)沼氣中甲烷含量，%；TSsubstratesadded為添加原料的總干物質(zhì)質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析使用 Microsoft Excel 2010（Microsoft Co.，Redmond，WA，USA），SPSS 20（IBM Co.，Armonk，NY，USA），Canoco for Windows 4.5（Biometris Plant Research International，Wageningen，The Netherlands）和 Origin 9.1（OriginLab Corporation，Northampton，MA 01060，USA）。方差分析使用Duncan的多范圍檢驗(yàn)，其顯著性P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過(guò)程中的VFA、pH值、堿度/VFA、sCOD/VFA的變化

厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中各指標(biāo)的變化可以檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程的好壞。甲烷發(fā)酵過(guò)程是微生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程，細(xì)菌將大分子有機(jī)物轉(zhuǎn)化為乙酸、乙醇、H2等小分子物質(zhì)，之后經(jīng)過(guò)產(chǎn)甲烷古菌的代謝，最終轉(zhuǎn)化為甲烷。因此，發(fā)酵環(huán)境的穩(wěn)定對(duì)于產(chǎn)甲烷量的多少有直接的關(guān)系，pH值、VFA[27]、sCOD/VFA[28]、堿度/VFA[28]是體現(xiàn)厭氧發(fā)酵環(huán)境穩(wěn)定性的指標(biāo)。厭氧發(fā)酵過(guò)程中VFA、sCOD/VFA、堿度/VFA及pH值的變化如圖1所示。在第0天，經(jīng)酶T、酶A預(yù)處理后，原始發(fā)酵液中總VFA分別比CK組高272.42%和203.03%，酶T預(yù)處理后，乙酸和丙酸大量增加，兩者占總VFA的92.68%，且乙酸占總VFA的72.25%。酶A預(yù)處理后丁酸大量增加，丁酸可以通過(guò)微生物代謝轉(zhuǎn)化為甲酸和乙酸，被產(chǎn)甲烷菌直接利用[27]。發(fā)酵 1 d后，VFA含量發(fā)生較大變化，主要體現(xiàn)在酶T、酶A預(yù)處理組中VFA濃度的急劇下降，酶T處理組減少的揮發(fā)性脂肪酸主要為乙酸和丙酸，分別減少了 93.31%和96.81%，減少后體系中幾乎不含乙酸和丙酸；酶A處理組減少的揮發(fā)性脂肪酸主要為乙酸和丁酸，減少量分別為89.49%和100%。而CK組VFA總量升高，主要體現(xiàn)在丙酸含量的增加。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，丙酸為VFA的主要組成酸。

圖1 厭氧發(fā)酵過(guò)程中VFA、sCOD/VFA、堿度/VFA及pH值的變化Fig.1 VFA, sCOD/VFA, alkalinity/VFA and pH value during anaerobic fermentation

在沼氣發(fā)酵中，sCOD是了解發(fā)酵液中可被氧化的有機(jī)物數(shù)量及掌握發(fā)酵進(jìn)程的極為重要的指標(biāo)。sCOD/VFA比值的變化規(guī)律和堿度/VFA的變化趨勢(shì)相同。發(fā)酵前2d波動(dòng)較大，發(fā)酵1d升到8.69和7.18；后期維持穩(wěn)定，保持在0.89～5.73之間。

2.2 酶預(yù)處理對(duì)玉米秸稈產(chǎn)甲烷的影響

圖 2所示為厭氧發(fā)酵過(guò)程中日產(chǎn)甲烷量和累積產(chǎn)甲烷量變化情況。經(jīng)過(guò)1 d的厭氧發(fā)酵，酶T處理組、酶A處理組產(chǎn)甲烷量分別為 59.34和 27.69 mL/g，顯著高于CK組（P<0.05），比 CK組分別提高了 403.67%和134.99%?？梢?jiàn)產(chǎn)甲烷量的增加來(lái)源于酶對(duì)玉米秸稈的預(yù)處理。預(yù)處理使VFA大量增加，乙酸、丙酸、丁酸含量的增加都為甲烷的生成提供了前體物質(zhì)。隨著有機(jī)酸的消耗，日產(chǎn)甲烷量逐漸下降。酶 T處理組的產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)在第1天（59.34 mL/g），顯著高于CK組（P<0.05），之后出現(xiàn)3次產(chǎn)氣高峰，但在發(fā)酵第8～14天日產(chǎn)甲烷量低于酶A處理組和CK組。酶A處理組在第5天產(chǎn)氣達(dá)到最高（41.05 mL/g），與CK組差異不顯著（P >0.05），且在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)出現(xiàn)6次產(chǎn)氣高峰。CK組初始日產(chǎn)甲烷量低，第3天達(dá)到日產(chǎn)甲烷最大值39.56 mL/g。可見(jiàn)酶預(yù)處理提高了玉米秸稈的最大日產(chǎn)甲烷量。酶T、酶A預(yù)處理組的累積產(chǎn)甲烷量始終高于CK組，發(fā)酵20 d累積產(chǎn)甲烷量顯著高于CK組（P<0.05），比CK組分別提高了7.79%和10.06%。酶T處理組在發(fā)酵前11天累積產(chǎn)甲烷量高于酶A處理組，之后降低，20天時(shí)累積產(chǎn)甲烷量與酶A處理組無(wú)顯著性差異（P >0.05）。

圖2 日產(chǎn)甲烷量及累積產(chǎn)甲烷Fig.2 Daily methane yield and cumulative methane yield

2.3 酶預(yù)處理對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物的影響

沼氣發(fā)酵過(guò)程需要經(jīng)歷水解、酸化、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸和產(chǎn)甲烷 4個(gè)生化過(guò)程，其中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是一系列原核生物，包括水解酸化細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌[13]。試驗(yàn)用哈茨木霉和黑曲霉利用農(nóng)業(yè)廢棄物經(jīng)固態(tài)發(fā)酵所制得的粗酶液作預(yù)處理劑。作為一種外源添加劑，粗酶液中的物質(zhì)是否會(huì)對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的微生物產(chǎn)生不利的影響，一直是本研究關(guān)注的重點(diǎn)，故而使用高通量測(cè)序測(cè)定發(fā)酵24 h樣品中的微生物來(lái)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中細(xì)菌和古菌的動(dòng)態(tài)變化。

2.3.1 酶預(yù)處理對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中細(xì)菌多樣性的沖擊

在門(mén)水平（圖3a），與接種污泥中細(xì)菌相比，酶T處理組、酶A處理組和CK組中菌群多樣性增加，體現(xiàn)在細(xì)菌所屬門(mén)種類(lèi)的增多。多樣性增加，系統(tǒng)會(huì)越趨穩(wěn)定。酶T、酶A處理組中擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）占比增加，分別比接種污泥增加了21.09%和15.27%，而CK組中擬桿菌門(mén)占比與接種污泥之間無(wú)顯著性差異。擬桿菌門(mén)在厭氧發(fā)酵過(guò)程中起著非常重要的作用，是厭氧發(fā)酵的主要發(fā)酵細(xì)菌，主要參與大分子復(fù)雜有機(jī)物的水解，可將碳水化合物降解為單糖，最終水解酸化為小分子的乙酸、乳酸、琥珀酸等；將脂類(lèi)水解為低級(jí)的脂肪酸和醇；也可以利用蛋白質(zhì)，將其降解為氨基酸和部分有機(jī)酸[29]。厚壁菌門(mén)（Firmicutes）在接種污泥中占47.02%，在酶T處理組、酶A處理組和CK組中分別有不同程度的下降。厚壁菌門(mén)在厭氧環(huán)境中大量存在，如厭氧反應(yīng)器及瘤胃中，是厭氧發(fā)酵過(guò)程中重要的酸化水解微生物，其通過(guò)分泌多種纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶及其他的胞外酶，將復(fù)雜的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、半纖維素、糖類(lèi)和氨基酸等有機(jī)物水解酸化。擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是厭氧體系中主要存在的兩大門(mén)類(lèi)，其總和在酶T處理組、酶A處理組、CK組和接種污泥中分別占75.68%，68.18%，60.91%，80.76%。CK組中螺旋體門(mén)（Spirochaetae）和互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes）占比增加，分別比接種污泥增加135.90%和168.78%，而酶T處理組中螺旋體門(mén)和互養(yǎng)菌門(mén)占比與接種污泥無(wú)顯著性差異。其中螺旋體門(mén)曾在白蟻的瘤胃中發(fā)現(xiàn)，大部分屬于密螺旋體屬（Treponema），能夠利用H2和CO2產(chǎn)生乙酸，為產(chǎn)甲烷階段的嗜乙酸產(chǎn)甲烷菌提供原料[30]。Dubinina 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，螺旋體科（Spirochaetaceae）可以利用多種碳水化合物包括纖維素和半纖維素。互養(yǎng)菌門(mén)是一類(lèi)革蘭氏陰性細(xì)菌，具有棒狀或弧狀的細(xì)胞形態(tài)，存在于很多厭氧環(huán)境中，如動(dòng)物的腸胃、土壤、油井或廢水處理廠中。目前已知的互養(yǎng)菌門(mén)的微生物均屬于Synergistia綱，Synergisiales科[32]。

在屬水平，Clostridium，VadinHA17，vadinBC27，Draconibacteriaceae及Ruminofilibacter為厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的主要細(xì)菌屬。Clostridium在接種污泥中占20.35%，加入玉米秸稈后，該菌屬占比下降，酶A處理組和CK組中該屬分別占6.78%和7.21%。vadinBC27在CK組中有明顯的減少，Terrisporobacter在CK組、酶T處理組和酶A處理組中明顯減少。由圖3b可見(jiàn)，在屬水平，酶T處理組、酶A處理組和CK組中占比大于1%的細(xì)菌低于接種污泥，主要體現(xiàn)在 Clostridium屬占比的顯著降低（P<0.05）。從細(xì)菌菌群多樣性熱圖（圖3c）中可以看出，F(xiàn)ibrobacter和Treponema占比低于其他組。酶A處理組和CK組中菌群組成親緣關(guān)系較近，其次是酶T處理組與酶A處理組和CK組菌群組成的親緣關(guān)系較近。由日產(chǎn)甲烷量變化規(guī)律也可以看出，酶A處理組和CK組有相同的變化規(guī)律，整體呈現(xiàn)同時(shí)升高同時(shí)降低的趨勢(shì)，而由于微生物菌群結(jié)構(gòu)的不同，酶T處理組與酶A處理組和CK組的日產(chǎn)甲烷變化規(guī)律不同。在第3～5天，酶T處理組日產(chǎn)甲烷較高，在第4天出現(xiàn)明顯的下降，但在第6天后，酶T處理組的日產(chǎn)甲烷下降，且低于酶A處理組和CK組，這也是在第12天，酶T處理組的累積產(chǎn)甲烷量開(kāi)始低于酶A處理組的原因。由此，盡管酶T處理組在厭氧發(fā)酵前期（0～12 d）占有優(yōu)勢(shì)，但在發(fā)酵后期產(chǎn)氣不及酶A預(yù)處理組。

圖3 細(xì)菌菌群多樣性Fig.3 Bacterial diversity

酶T處理組中有9個(gè)屬的微生物豐度極顯著高于CK組，其中Clostridium，vadinBC27，Ruminofilibacter都與纖維素的降解有關(guān)，可見(jiàn)酶 T處理組增加了促進(jìn)纖維素降解微生物的菌群豐度，這在反應(yīng)體系物質(zhì)轉(zhuǎn)化中具有重要的促進(jìn)作用，可為產(chǎn)甲烷菌提供更多的前體物質(zhì)。

酶A處理組中僅有5個(gè)屬的微生物豐度極顯著高于CK 組，分別為 vadinBC27，Ruminofilibacter和Christensenellaceae，以及未知細(xì)菌屬；而 Treponema，Terrisporobacter，Turicibacter等5個(gè)屬與CK組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明酶A處理組與CK組中微生物菌群結(jié)構(gòu)相近，且從日產(chǎn)甲烷量變化可以看出，酶A處理組和CK組的日產(chǎn)甲烷具有相同的變化規(guī)律。可見(jiàn)，酶預(yù)處理增強(qiáng)了與纖維素分解相關(guān)的細(xì)菌的豐度，對(duì)厭氧發(fā)酵是有利的。

2.3.2 酶預(yù)處理對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中古菌多樣性的沖擊

從古菌菌群結(jié)構(gòu)中可以看出，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的古菌在屬水平上（圖4a）主要為甲烷絲菌屬（Methanosaeta）、深古菌門(mén)（Bathyarchaeota）、Methanosarcina、Deep sea Euryarchaeotic Group-DSEG以及Methanobacterium。

圖4 古菌菌群多樣性和熱圖分析Fig.4 Archaea diversity on genus level and heat map in archaea community

酶 T處理組的 Methanosaeta下降，Bathyarchaeota增加，其中甲烷絲菌屬（Methanosaeta）為乙酸營(yíng)養(yǎng)型古菌，專(zhuān)營(yíng)性嗜乙酸，一般在中溫環(huán)境中存在。深古菌（Bathyarchaeota）的一些類(lèi)群具有豐富多樣的代謝方式，既可以降解環(huán)境中的難降解大分子如芳香化合物、幾丁質(zhì)、纖維素和蛋白質(zhì)等，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生乙酸等小分子化合物，也可以利用CO2和H2通過(guò)自養(yǎng)產(chǎn)乙酸途徑獲取能量。深古菌產(chǎn)生的乙酸是重要的電子載體，可以被產(chǎn)甲烷菌和異養(yǎng)細(xì)菌所利用，是深部碳循環(huán)和生態(tài)系統(tǒng)的核心驅(qū)動(dòng)者[33]。Deep sea Euryarchaeotic Group-DSEG在酶T處理組、酶A處理組和CK組中大量增加，推測(cè)該菌在纖維素分解中具有積極作用。接種污泥中甲烷桿菌屬（Methanobacterium）和第七產(chǎn)甲烷古菌目馬氏甲烷球菌科（Methanomassiliicoccus）在酶T處理組、酶A處理組和CK組中均有所降低。馬氏甲烷球菌科為甲基型產(chǎn)甲烷古菌，擁有較為獨(dú)特的代謝特性，與傳統(tǒng)的專(zhuān)性甲基型產(chǎn)甲烷古菌不同，其缺少將CO2還原為甲基輔酶M 的完整途徑[34]，因此這類(lèi)菌需要額外添加H2才能生長(zhǎng)。基因組分析表明，它們含有一些基因，可利用H2還原甲醇、甲胺、二甲胺等底物，因此，Methanomassiliicoccus即非典型的甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，又非典型的氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，屬于兩者的混合型[35]。

從古菌熱圖4b上看，接種污泥中Methanoregula（屬于甲烷微菌目 Methanomicrobiales：氫營(yíng)養(yǎng)型）和Methanolacinia 2種產(chǎn)甲烷古菌豐度低于其他組，但Methanobacterium高于其他組。菌群組成親緣關(guān)系酶 A處理組與CK組最近，其次是酶T處理組與酶A處理組和酶T處理組與CK組。

在豐度前15的屬中，酶T處理組中有8個(gè)屬的微生物豐度極顯著高于 CK組，2個(gè)屬顯著高于 CK組（P<0.05），1個(gè)屬與CK組無(wú)顯著性差異（P >0.05）。說(shuō)明酶 T處理組的處理效果顯著影響了厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷古菌的分布。酶A處理組中有4個(gè)屬的微生物豐度極顯著高于CK組，2個(gè)屬顯著高于CK組，6個(gè)屬與CK組無(wú)顯著性差異。說(shuō)明酶A處理組中產(chǎn)甲烷古菌的分布與CK組中的產(chǎn)甲烷古菌差異不大，具有近的親緣關(guān)系。

2.4 微生物與環(huán)境因子之間的關(guān)系及對(duì)產(chǎn)甲烷的影響

圖5為微生物與環(huán)境因子之間的冗余分析。圖5a為細(xì)菌在門(mén)水平與發(fā)酵初始指標(biāo)及發(fā)酵結(jié)束后累積產(chǎn)甲烷量的相關(guān)關(guān)系?？梢钥闯?，酶T處理組、酶A處理組和CK組3組分別處于不同象限，說(shuō)明三者的物種組成不相似。甲烷產(chǎn)量與VFA、乙酸、sCOD、丙酸、乳酸和甲酸均呈正相關(guān)，說(shuō)明這些條件共同決定了甲烷的生成。pH值分別與VFA和堿度具有大小一致的夾角且在pH值兩側(cè)均呈正相關(guān)，說(shuō)明VFA和堿度的動(dòng)態(tài)平衡共同決定了發(fā)酵系統(tǒng)中pH值的穩(wěn)定。厚壁菌門(mén)、WS6、變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在酶T處理組中豐度高于酶A處理組和CK組，且與VFA和sCOD呈正相關(guān)，說(shuō)明這些細(xì)菌對(duì)于VFA的利用和 sCOD的轉(zhuǎn)化起到重要的作用。在屬水平上（圖5b），嗜乙酸的菌屬Ruminofilibacter，Ruminococcaceae，vadinHA17和Draconibacteriaceae與乙酸呈正相關(guān)，體現(xiàn)了細(xì)菌的代謝特性與環(huán)境之間的相關(guān)關(guān)系。

古菌屬水平上的相關(guān)關(guān)系如圖 5c所示，除 ARC26和Methanosaeta外，其他古菌屬均處在VFA，sCOD的正相關(guān)位置，在復(fù)雜的厭氧環(huán)境中，這些微生物能夠利用VFA中的乙酸、丙酸等及sCOD直接或間接地產(chǎn)生甲烷，從而合力完成玉米秸稈的甲烷發(fā)酵。酶 T處理組與酶A處理組和CK組相比，產(chǎn)甲烷古菌的豐度更高，這也解釋了發(fā)酵前12 d酶T處理組的累積產(chǎn)甲烷量高于酶A處理組和CK組。可見(jiàn)，發(fā)酵過(guò)程中微生物的菌群結(jié)構(gòu)對(duì)于發(fā)酵效果及產(chǎn)甲烷量起著重要的作用。初始發(fā)酵條件能夠影響發(fā)酵系統(tǒng)中的菌群結(jié)構(gòu)，有效的預(yù)處理對(duì)于改善發(fā)酵起始條件具有重要的調(diào)節(jié)作用。

圖5 微生物與環(huán)境間的RDA分析Fig.5 RDA analysis between microorganism and environment

3 結(jié) 論

本研究利用哈茨木霉和黑曲霉通過(guò)固態(tài)發(fā)酵從農(nóng)業(yè)廢棄物中生產(chǎn)木質(zhì)纖維素分解酶，用于玉米秸稈厭氧發(fā)酵的前處理。研究發(fā)現(xiàn)：

1）在玉米秸稈的厭氧發(fā)酵過(guò)程中，酶T處理組、酶A處理組發(fā)酵起始VFA濃度增加，主要體現(xiàn)為乙酸的增加；后期丙酸為VFA的重要組成酸；sCOD/VFA具有和堿度/VFA相同的變化趨勢(shì)。

2）經(jīng)過(guò)6 d的預(yù)處理，酶T處理組和酶A處理組玉米秸稈厭氧發(fā)酵20 d的累積產(chǎn)甲烷量較對(duì)照組分別提高了7.79%和10.06%。纖維素酶的預(yù)處理在秸稈的甲烷轉(zhuǎn)化中起到了積極的促進(jìn)作用。

3）厭氧發(fā)酵24 h，酶T處理組中9個(gè)屬的細(xì)菌豐度顯著高于 CK組，其中 Clostridium，vadinBC27，Ruminofilibacter與纖維素的降解有關(guān)。酶預(yù)處理增強(qiáng)了厭氧發(fā)酵體系中分解纖維素細(xì)菌的豐度，從而促進(jìn)纖維素分解，使之分解成產(chǎn)甲烷菌易于利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。發(fā)酵系統(tǒng)中古菌主要為 Methanosaeta，Bathyarchaeota，Methanosarcina及Methanobacterium等。預(yù)處理影響了發(fā)酵系統(tǒng)中微生物的菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)改善發(fā)酵條件具有重要的調(diào)節(jié)作用。

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