骨膠原蛋白-殼聚糖共混膜中分子間作用紅外光譜分析

高玲玲，王振宇，饒偉麗，曹立創(chuàng)，張德權(quán)

0 引 言

近年來，塑料包裝材料的不可降解性和不可循環(huán)性已經(jīng)引起了嚴(yán)重的環(huán)境問題。同時，隨著消費者對營養(yǎng)健康的關(guān)注，研究開發(fā)生物可降解膜已經(jīng)成為食品包裝領(lǐng)域的重要趨勢。膠原蛋白具有良好的成膜特性和生物相容性，是可食性生物膜的重要材料來源。

膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)，占動物總蛋白的 30%左右，主要存在于動物的肌腱、軟骨、骨和皮等結(jié)締組織中[1-3]。我國畜禽骨副產(chǎn)物產(chǎn)量巨大，但加工利用率低，造成了極大了資源浪費。膠原蛋白作為骨的主要組成物質(zhì)，具有極高的可開發(fā)利用價值。另外，膠原蛋白膜可以作為抗氧化劑和抗菌劑的載體應(yīng)用于食品包裝中[4-5]。然而，純膠原蛋白膜的表面粗糙、易變性且機械特性較差，一定程度上限制了它的應(yīng)用。殼聚糖是甲殼素經(jīng)脫乙?；磻?yīng)后得到的一種天然多聚物，含量豐富，具有良好的抑菌性和成膜性和機械特性[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白和殼聚糖共混膜的成膜特性優(yōu)于單一組分膜，使得共混膜更適用于食品包裝[7-8]。在成膜過程中，膠原蛋白和殼聚糖可能通過分子構(gòu)象變化和分子間相互作用形成復(fù)雜的復(fù)合物。膠原蛋白的-OH、-NH2、-COOH基團(tuán)等可能與殼聚糖的-NH2和-COOH等基團(tuán)形成分子間氫鍵相互作用[9]。殼聚糖的-NH2在酸性環(huán)境下容易被質(zhì)子化形成-NH3+，并與呈陰離子性的膠原蛋白形成靜電作用。因此，明確成膜過程中膠原蛋白和殼聚糖分子間的相互作用情況對優(yōu)化共混膜的成膜特性十分重要。目前，已有研究通過共混膜紅外光譜中吸收峰峰位和強度變化，初步探討了成膜過程中 2種物質(zhì)的相互作用情況，并推斷膠原蛋白與殼聚糖分子間形成了氫鍵和靜電相互作用[9-11]。

二維紅外相關(guān)光譜法是將數(shù)學(xué)相關(guān)分析技術(shù)用于紅外光譜中，研究在外源因素的干擾下分子內(nèi)官能團(tuán)間相互作用和分子間相互作用的方法[12-13]。二維紅外相關(guān)光譜還可以獲得分子中官能團(tuán)對外擾因素的敏感程度和響應(yīng)順序。二維紅外相關(guān)光譜法被廣泛用于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化和分子間相互作用研究等[13-16]。然而，目前通過二維紅外相關(guān)光譜法研究骨膠原蛋白和殼聚糖之間的相互作用情況的研究報道較少。因此，本文以骨膠原蛋白和殼聚糖混合比例為外擾，通過分峰擬合和二維相關(guān)分析方法，明確成膜過程中骨膠原蛋白與殼聚糖分子間的相互作用情況，為共混膜分子間相互作用的應(yīng)用提供新思路，進(jìn)而為膠原蛋白-殼聚糖膜的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊骨購買自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟額爾敦肉類食品有限公司；胃蛋白酶（美國Amresco公司）；殼聚糖（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甘油（美國 Amresco公司）；乙酸、氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

凍干機（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司 LGJ-25型冷阱溫度：≤-62 ℃極限真空度：≤10 Pa（空載））

磁力攪拌器（EMS-19天津歐諾儀器儀表有限公司攪拌容量(10-3000)×6（10 L），加熱功率(50-300)×6）

烘箱（寧波江南儀器廠 控溫范圍：室溫+10~200 ℃溫度波動：±1 ℃）

水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司 DK-S26 控溫范圍+5～100 ℃溫度波動：±1 ℃）

超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司KH7200DE 超聲頻率40控溫范圍 常溫~80 ℃）

紅外光譜儀（德國Bruker Tensor 27分辨率：0.5 cm–1光譜范圍：7500~370 cm–1）。

1.3 羊骨膠原蛋白提取

骨膠原蛋白提取方法參考Ruili zhang等[1]的方法，修改提取時的料液比和胃蛋白酶用量。新鮮烏珠穆沁羊骨購買自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟，–20℃保存。清洗破碎后，進(jìn)行除雜蛋白、脫脂和脫鈣處理。采用胃蛋白酶-乙酸法提取羊骨膠原蛋白，取脫鈣骨粉以1:10（w/v）料液比置于胃蛋白酶-乙酸溶液中，胃蛋白酶與骨粉的用量比為20 U/g，磁力攪拌3 d提取骨膠原蛋白。通過鹽析和透析純化并凍干得到酶溶性羊骨膠原蛋白。

1.4 膠原蛋白-殼聚糖共混膜制備

取骨膠原蛋白和殼聚糖分別溶于0.5 M乙酸中，制成濃度為 1.5%骨膠原蛋白和 1.5%殼聚糖（w/v）的成膜液，攪拌均勻。將骨膠原蛋白（BC）和殼聚糖（CS）的乙酸成膜液分別按照100:0、60:40、50:50、40:60和0:100體積比混合均勻，40 ℃恒溫水浴攪拌30 min。冷卻后，加入 25%（以溶質(zhì)質(zhì)量計）的甘油作為增塑劑，攪拌均勻后超聲脫氣30 min形成鑄膜液。將鑄膜液均勻倒在塑料成膜器內(nèi)，50 ℃干燥18 h，再于室溫放置6 h后揭膜。膜樣品置于25 ± 0.5 ℃、50% ± 5%相對濕度（飽和溴化鈉溶液）的干燥器中保存待分析。按照不同混合比例，各處理組分別命名為：100 BC:0 CS、60 BC:40 CS、50 BC:50 CS、40 BC:60 CS和0 BC:100 CS。

1.5 膠原蛋白-殼聚糖共混膜紅外光譜

膠原蛋白-殼聚糖共混膜覆蓋在紅外光譜晶胞上，壓緊，25 ℃下采用全反射傅里葉變換紅外光譜（Total reflectance fourier transform infrared spectroscopic，ATRFTIR）法進(jìn)行測定膠原蛋白-殼聚糖共混膜在波數(shù) 600~4000 cm–1范圍內(nèi)的紅外光譜，掃描分辨率為0.5 cm–1，以空氣為空白。

1.6 膠原蛋白-殼聚糖共混膜分峰擬合

參考倪娜[17]、Barth[18]、Shudong H.[19]等的研究，使用 Peaktit 4.12軟件對膠原蛋白-殼聚糖共混膜在800~1700 cm–1波長范圍內(nèi)的圖譜進(jìn)行分峰擬合。根據(jù)酰胺I區(qū)域各子吸收峰的峰位歸屬情況，計算膠原蛋白各個二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲）的相對百分含量。

1.7 膠原蛋白-殼聚糖共混膜二維紅外相關(guān)分析

采用2D Shige軟件（KwanseiGakuin）繪制以等高線表征的二維相關(guān)圖譜。根據(jù)二維相關(guān)分析讀譜規(guī)則[15]，確定各基團(tuán)響應(yīng)順序。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨膠原蛋白-殼聚糖共混膜紅外光譜

如圖 1所示為膠原蛋白-殼聚糖共混膜在 600~4000 cm–1波數(shù)范圍內(nèi)的紅外光譜圖。通常，酰胺A區(qū)域最大吸收峰位于波數(shù)3400~3440 cm–1之間，主要涉及N-H和O-H伸縮振動。當(dāng)N-H與氫鍵締合后，吸收峰向短波位移[20]。純骨膠原蛋白膜酰胺 A最大吸收峰位于波數(shù)3292 cm–1，表明純骨膠原蛋白膜分子中含有大量氫鍵。當(dāng)殼聚糖添加量為60%時，酰胺A最大吸收峰向短波遷移至波數(shù) 3290 cm–1處，峰形由強的尖銳峰變成弱的寬鈍峰，可能是添加殼聚糖后，O-H鍵振動峰與N-H鍵振動峰重疊，并增強了成膜組分間的氫鍵作用。添加殼聚糖后，共混膜在波數(shù) 3080 cm–1處的肩峰向長波方向遷移4 cm–1。酰胺B區(qū)域涉及2927 cm–1處的CH2不對稱伸縮振動和2875 cm–1處的CH2對稱伸縮振動[10]。隨著殼聚糖添加量增大，羊骨膠原蛋白-殼聚糖共混膜在2927 cm–1處吸收峰強度逐漸增大，基團(tuán)振動強度增大，可能與殼聚糖分子中CH2基團(tuán)振動有關(guān)。

圖1 羊骨膠原蛋白-殼聚糖共混膜紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of bones collagen-chitosan blend films

機械特性結(jié)果顯示添加殼聚糖能夠顯著提高骨膠原蛋白膜的拉伸強度，且隨著殼聚糖添加量增大，骨膠原蛋白-殼聚糖共混膜的拉伸強度先升高后略微降低。當(dāng)骨膠原蛋白與殼聚糖添加比例為 3∶2時，羊骨膠原蛋白-殼聚糖膜的拉伸強度最大，推測此時兩者的相互作用力最強。殼聚糖分子排列在膠原蛋白分子間，并且與膠原蛋白分子間通過氫鍵結(jié)合，可替代膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)的作用，提高了膜的拉伸強度[9]。當(dāng)殼聚糖含量進(jìn)一步增加時，少量存在的膠原蛋白削弱了殼聚糖分子間相互作用力，損害了殼聚糖膜的完整結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致共混膜的拉伸強度降低。整體來看，隨著殼聚糖含量增加，骨膠原蛋白-殼聚糖膜的斷裂延伸率逐漸降低。少量殼聚糖的加入（小于50%）對膠原蛋白膜的斷裂延伸率無顯著影響。而殼聚糖含量較高時，殼聚糖分子間形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以及與膠原蛋白之間形成的相互作用降低了成膜分子的流動性，導(dǎo)致混合膜的斷裂延伸率降低。Gómez-Estaca等[7]研究發(fā)現(xiàn)添加殼聚糖后，金槍魚皮明膠-殼聚糖共混膜的拉伸強度從8~10 MPa升高到18 MPa，斷裂延伸率降低了11%~14%。Jeya Shakila等[8]也報道，添加殼聚糖后，明膠膜的拉伸強度增大，但斷裂延伸率下降。同時，他們也發(fā)現(xiàn)不同來源的膠原蛋白膜拉伸強度不同，哺乳動物源膠原蛋白膜拉伸強度大于魚源膠原蛋白。

紅外光譜圖中波數(shù)1600~1700 cm–1波數(shù)范圍內(nèi)的吸收峰為酰胺I區(qū)域，涉及多肽鏈骨架上的C=O伸縮振動[21]和殼聚糖乙?；系腃=O伸縮振動。殼聚糖脫乙?；磻?yīng)后，分子側(cè)鏈中-NH2基團(tuán)取代了-NHCOCH3基團(tuán)，因此殼聚糖脫乙?；潭仍礁?，殼聚糖酰胺I吸收峰強度越小[22]。本研究中，純殼聚糖膜酰胺I區(qū)域僅在波數(shù)1640 cm–1附近存在一個較小的肩峰，表明本研究中殼聚糖的脫乙酰化程度較高，分子側(cè)鏈主要為 NH2基團(tuán)。純骨膠原蛋白膜酰胺I最大吸收峰位于波數(shù)1633 cm–1處，當(dāng)殼聚糖添加量大于50%時，酰胺I區(qū)域的最大吸收峰向長波方向遷移至波數(shù)1635 cm–1處，推測可能是殼聚糖與膠原蛋白形成了分子間相互作用，改變了膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)。由于蛋白質(zhì)酰胺 I區(qū)域的吸收峰特征極少受到蛋白質(zhì)側(cè)鏈構(gòu)象的影響，因此其主要用于分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[18]。蛋白質(zhì)各二級結(jié)構(gòu)在酰胺I區(qū)域出現(xiàn)的順序為：α-螺旋1645~1659 cm–1、β-折疊或伸展結(jié)構(gòu) 1620~1640 cm–1、β-轉(zhuǎn)角 1660~1700 cm–1、無規(guī)則卷曲 1640~1644 cm–1[23]。對酰胺 I區(qū)域進(jìn)行分峰擬合分析，結(jié)合吸收峰歸屬情況證實，共混膜中骨膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為 β-折疊。天然膠原蛋白為三螺旋結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)主要是 α-螺旋，受熱易發(fā)生變性，三螺旋結(jié)構(gòu)域解旋，分子伸展[3,24]。共混膜中膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)變化可能是成膜工藝導(dǎo)致的，如成膜組分的共混溫度和干燥溫度。如圖 2所示，加入殼聚糖后，膠原蛋白的α-螺旋含量減少，β-轉(zhuǎn)角和折疊含量增加，表明加入殼聚糖后，膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)更加舒展，有利于分子間相互作用的形成，分子相容性較好，易混合。

圖2 共混膜中膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)相對百分含量Fig.2 Relative percent content of secondary structure of bone collagen in blend films

波數(shù)1550~1600 cm–1范圍內(nèi)吸收峰為酰胺II區(qū)域，主要涉及 N-H彎曲振動（40%~60%）和 C-N伸縮振動（18%~40%）[25]。純骨膠原蛋白膜酰胺II最大吸收峰位于波數(shù)1541 cm–1處。添加殼聚糖后，共混膜的最大吸收峰遷移至波數(shù)1535 cm–1處（50BC:50CS），純殼聚糖膜酰胺II最大吸收峰位于波數(shù)1552 cm–1處。殼聚糖分子側(cè)鏈的-NH2基團(tuán)可通過質(zhì)子化形成-NH3+[10]，因此酰胺 II最大吸收峰位置的改變可能與混合物中 N-H振動類型和強度的變化有關(guān)。如圖3所示，酰胺II分峰擬合結(jié)果表明，共混膜酰胺II區(qū)域包括6個子吸收峰：1501、1518、1539、1554、1573 和 1583 cm–1。其中，1518 cm–1歸屬于-NH3+對稱變角振動，1539 cm–1歸屬于N-H彎曲振動和C-N伸縮振動，1583 cm–1歸屬于NH2振動[22]。與單一組分膜相比，混合膜1518 cm–1吸收峰強度減小，1539 cm–1吸收峰強度增大，推測原因是殼聚糖的-NH3+基團(tuán)在成膜過程中參與了分子間靜電作用的形成。

圖3 共混膜酰胺II區(qū)域分峰擬合圖Fig.3 Curve-fitting figures of amide II band of blend films

隨著殼聚糖含量增加，共混膜在波數(shù)1450 cm–1（涉及CH2彎曲振動）、1403 cm–1（COO—對稱伸縮振動）[26]處的吸收峰強度減弱，且波數(shù) 1450 cm–1吸收峰（100BC:0CS）遷移至波數(shù) 1448 cm–1處（40BC:60CS）。游離COO—歸屬于膠原蛋白分子，使得膠原蛋白分子呈現(xiàn)陰離子特性，推測1403 cm–1吸收峰強度的改變可能與共混膜中分子間靜電作用形成有關(guān)。波數(shù)1334 cm–1處最大吸收峰歸屬 CH2搖擺振動，該峰位置隨著殼聚糖含量增加無顯著變化。殼聚糖添加量為60%時，在波數(shù)1377 cm–1出現(xiàn)肩峰，歸屬于殼聚糖CH2彎曲振動。

膠原蛋白酰胺 III 區(qū)域涉及到的基團(tuán)和特征吸收峰較多，通常包括C-N伸縮振動、酰胺鍵N-H彎曲振動以及Gly骨架和Pro側(cè)鏈上的CH2搖擺振動[18,27]，主要用于分析蛋白質(zhì)分子間及其與其他分子間的相互作用力。殼聚糖在波數(shù)~1200 cm–1內(nèi)主要歸屬于多糖鏈的骨架振動，主要涉及-C-O-C-不對稱伸縮振動[28]。純骨膠原蛋白膜在波數(shù)1236 cm–1處的吸收峰歸屬于N-H彎曲振動和C-N伸縮振動。隨著殼聚糖添加量增大，共混膜在波數(shù)1236 cm–1處吸收強度不斷減小，吸收峰位置紅移至1240 cm–1（40BC:60CS），純殼聚糖膜酰胺III最大吸收峰位于波數(shù)1261 cm–1處。前人研究認(rèn)為，波數(shù)1238 cm–1和1240 cm–1處最大吸收峰吸光度的比值越接近1.0，膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)域保持越完整[29]。本研究中羊骨膠原蛋白-殼聚糖共混膜在2處吸光度的比值均遠(yuǎn)離1.0，說明膜結(jié)構(gòu)中膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，這與酰胺 I分峰擬合結(jié)果一致。由于本研究中成膜溫度在50℃以下，因此骨膠原蛋白的單肽鏈未發(fā)生降解。波數(shù)1163 cm–1處的吸收峰歸屬于COO-C不對稱伸縮振動[30]，純骨膠原蛋白膜在此處的吸收峰極小，隨著殼聚糖添加量增大，該處吸收峰強度增大，逐漸藍(lán)移至波數(shù)1157 cm–1處（40BC:60CS），純殼聚糖膜位于波數(shù)1151 cm–1，表明COO-C在成膜過程中參與了分子間作用力的形成。隨著殼聚糖含量增加，共混膜在波數(shù)1203 cm–1處的吸收峰強度減弱。波數(shù)1035 cm–1處的強且尖銳吸收峰歸屬于分子骨架上-C-O-C-伸縮振動[31-32]。隨著殼聚糖含量增加，1035 cm–1處吸收峰強度增強，1080 cm–1處的吸收峰與1035 cm–1重疊。

綜上所述，根據(jù)不同波數(shù)處吸收峰強度和位置的變化可推斷，在共混膜成膜過程中，膠原蛋白與殼聚糖分子間形成氫鍵和靜電相互作用，并且其作用強度與膠原蛋白和殼聚糖兩者的混合比例有關(guān)。

2.2 共混膜二維紅外相關(guān)分析

為進(jìn)一步明確膠原蛋白和殼聚糖分子間相互作用力的詳細(xì)信息，以殼聚糖添加量為外擾，對共混膜在波數(shù)2850~3350 cm–1、1200~1700 cm–1和 850~1300 cm–1波長范圍內(nèi)的紅外光譜進(jìn)行二維相關(guān)分析。研究在外源因素的干擾下分子內(nèi)官能團(tuán)間相互作用和分子間相互作用的方法[12,13]。根據(jù)二維紅外相關(guān)光譜中同步光譜（Φ）和異步光譜（Ψ）中2個波長變化的正負(fù)關(guān)系，可以獲得分子中官能團(tuán)對外擾因素的敏感程度和響應(yīng)順序。根據(jù)二維相關(guān)光譜讀譜規(guī)則[12,15,33]，同步光譜中，自相關(guān)峰的強度大小代表在相關(guān)周期中光強度動態(tài)漲落的總程度，說明這些振動峰對應(yīng)的基團(tuán)隨濃度的改變而發(fā)生變化[33]。自相關(guān)峰代表吸收峰帶對殼聚糖組分增加的敏感程度，同步交叉峰是不同官能團(tuán)振動同時取向產(chǎn)生的，這種微觀結(jié)構(gòu)的同步性表明基團(tuán)之間有很強的協(xié)同作用或可能存在強烈的相互作用。所以，骨膠原蛋白-殼聚糖共混物的同步交叉峰存在以下關(guān)系：Φ[ν（骨膠原蛋白），ν（骨膠原蛋白）] > 0，Φ[ ν（殼聚糖），ν（殼聚糖）] > 0，Φ[ ν（骨膠原蛋白），ν（殼聚糖）] < 0，Φ[ ν（殼聚糖），ν（骨膠原蛋白）] < 0。利用這種規(guī)律可以鑒別出各譜峰的具體歸屬。異步光譜可以為同步光譜提供一些補充信息，二維異步相關(guān)譜沒有自相關(guān)峰，只有一系列關(guān)于主對角線反對稱的交叉峰，代表了在ν1和ν2處的光譜強度變化順序或變化的不同步性。本文所有異步相關(guān)峰均由于骨膠原蛋白-殼聚糖共混物分子構(gòu)象和分子間相互作用的變化引起，因為簡單的組分濃度變化只會導(dǎo)致吸收強度的增減，不會形成異步峰[13,14]。根據(jù)Noda規(guī)則[12]可以判斷出隨著殼聚糖組分含量的增加，波長ν1和ν2的變化順序。當(dāng) Φ（ν1，ν2）>0，Ψ（ν1，ν2）<0，或 Φ（ν1，ν2）<0，Ψ（ν1，ν2）>0時，ν1處強度變化滯后于ν2處強度變化；當(dāng) Φ（ν1，ν2）>0, Ψ（ν1，ν2）>0，或 Φ（ν1，ν2）< 0，Ψ（ν1，ν2）<0時，ν1處強度變化優(yōu)先于ν2處強度變化。

如圖4所示，隨著膠原蛋白含量減少，波數(shù)3292和2927 cm–1吸收峰強度均減小，在二維相關(guān)光譜中，2處吸收峰變化具有同向性，因此二維相關(guān)光譜中，2處的吸收峰歸屬于膠原蛋白基團(tuán)，且N-H伸縮振動首先參與新氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。

圖4 共混膜在二維紅外相關(guān)光譜Fig.4 Two-dimensional infrared correlation spectra of blend films

共混膜在波數(shù)1633 cm–1處出現(xiàn)強自動吸收峰，說明C=O基團(tuán)對混合比例變化響應(yīng)敏感，進(jìn)一步證明，添加殼聚糖后膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)舒展，二級結(jié)構(gòu)中 α-螺旋含量減少，β-轉(zhuǎn)角和折疊含量增多，有利于與殼聚糖分子形成分子間相互作用。隨著膠原蛋白含量減少，酰胺I吸收峰強度減小，且脫乙?；潭容^高的殼聚糖分子側(cè)鏈主要為-NH2基團(tuán)，說明C=O基團(tuán)歸屬于膠原蛋白。因此，根據(jù)二維相關(guān)光譜讀譜規(guī)則，波數(shù)1452、1334和1236 cm–1處紅外振動吸收峰也屬于膠原蛋白基團(tuán)，且波數(shù)1633 cm–1優(yōu)先于波數(shù)1452、1334和1236 cm–1處吸收峰變化，表明成膜過程中，膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化優(yōu)先于CH2、N-H和C-N等基團(tuán)構(gòu)象的變化。

如圖5所示為共混膜酰胺III區(qū)域分峰擬合圖，由圖5可知，純膠原蛋白膜酰胺II區(qū)域包括3個主要子吸收峰：1204、1236 和 1274 cm–1，其中1236和 1274 cm–1為 N-H和C-N不同的空間構(gòu)象。添加殼聚糖后，1204 cm–1子吸收峰強度逐漸減少，為Hyp特征振動吸收峰[34]。1236和1274 cm–12基團(tuán)構(gòu)象逐漸轉(zhuǎn)變成 1261 cm–1處。波數(shù)1100-900 cm–1范圍主要為多糖C–O–C骨架振動的紅外吸收峰。二維相關(guān)光譜證明，成膜過程中，殼聚糖的C–O–C參與了分子間相互作用的形成。因此，根據(jù)表1判斷，成膜過程中各基團(tuán)的變化順序為：1633 cm–1> 1448 cm–1>1236 cm–1> 1068 cm–1> 997 cm–1> 896 cm–1。

除上述相關(guān)吸收峰外，在波數(shù)1200-1700 cm–1（d）異步光譜中，存在正吸收峰：(1539, 1573)、(1452, 1510)、(1274, 1502)、(1236, 1573)、(1236, 1510)、(1236, 1404)、(1204, 1510)，和負(fù)吸收峰：(1573, 1639)、(1510, 1639)、(1510, 1539)、(1404, 1452)、(1377, 1515)、(1377, 1402)、(1310, 1639)、(1404, 1525)。在波數(shù) 850-1300 cm–1（f）異步光譜中，存在正吸收峰：(1078, 1113)、(1010, 1113)、(1010, 1035)、(962, 1035)、(920, 1035)、(860, 1035)，和負(fù)吸收峰：(1151, 1236)、(1078, 1113)、(1035, 1197)、(1035,1082)、(1010, 1236)、(1010, 1197)、(1010, 1151)、(995,1151)、(966, 1082)、(945, 1082)、(910, 1261)、(896, 1151)、(896, 1082)。以上相關(guān)吸收峰主要涉及酰胺II區(qū)域N-H鍵（包括-NH、-NH3+、-NH2基團(tuán)）和多糖骨架 C–O–C等基團(tuán)振動。殼聚糖骨架C–O–C鍵振動可能是殼聚糖空間構(gòu)象變化所引起的。（1404, 1525）異步相關(guān)峰證明，膠原蛋白的 COO–和-NH3+形成了靜電相互作用。由于異步相關(guān)峰是由骨膠原蛋白-殼聚糖共混物分子構(gòu)象和分子間相互作用的變化引起，因此二維異步相關(guān)光譜證實，成膜過程中膠原蛋白和殼聚糖分子基團(tuán)間形成了氫鍵和靜電相互作用。

表1 成膜組分基團(tuán)二維相關(guān)光譜中響應(yīng)順序Table 1 The order of band intensity variations of film components

圖5 共混膜在波數(shù)900~1480 cm–1區(qū)域的分峰擬合圖Fig.5 Curve-fitting results of band of blend films in the region of 900~1480 cm–1

3 結(jié) 論

本研究采用紅外光譜分峰擬合和二維紅外相關(guān)分析法明確了膠原蛋白-殼聚糖共混膜的分子間相互作用情況。結(jié)果表明：

1）添加殼聚糖后，共混膜紅外光譜的酰胺A 向短波遷移2 cm–1，峰形由強的尖銳峰變成弱的寬鈍峰，酰胺B峰強度增大，酰胺I向長波遷移2 cm–1，膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成發(fā)生改變，酰胺III區(qū)域主要吸收峰位置發(fā)生遷移，表明膠原蛋白與殼聚糖分子間形成了氫鍵作用；酰胺II分峰擬合結(jié)果表明殼聚糖的-NH2基團(tuán)質(zhì)子化形成-NH3+，表明膠原蛋白和殼聚糖之間形成了靜電相互作用；

2）成膜過程中，膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量減少，β-折疊和 β-轉(zhuǎn)角含量增加，表明膠原蛋白結(jié)構(gòu)更加舒展，活性基團(tuán)暴露；

3）二維相關(guān)分析結(jié)果表明，共混膜成膜過程中膠原蛋白 C=O基團(tuán)構(gòu)象率先改變，此外 N-H、C-N、-NH、-NH3+、-NH2基團(tuán)和多糖骨架C–O–C等基團(tuán)的構(gòu)象也受到了成膜組分混合比例的影響，表明膠原蛋白與殼聚糖分子間相互作用強度與膠原蛋白和殼聚糖兩者的混合比例有關(guān)。

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