全氟辛酸暴露對(duì)哮喘小鼠炎癥介質(zhì)IL-4和IFN-γ及糖皮質(zhì)激素受體的影響*

馬偉慧， 盧賀敏， 葉樂平

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院/育英兒童醫(yī)院兒童呼吸科， 浙江 溫州 325027)

支氣管哮喘(bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘)是兒童最常見的由多種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與的氣道慢性炎癥性疾病。化學(xué)因素、感染因素、宮內(nèi)及嬰幼兒期暴露等諸多因素可影響機(jī)體對(duì)哮喘的易感性。隨著工業(yè)發(fā)展和城市化進(jìn)程的加快，環(huán)境因素在哮喘發(fā)病中的作用日益受到重視。全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)是具有代表性的一種全氟化合物(perfluorinated compounds，PFCs)，因其具有高度的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性以及較高的疏水疏油特性，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各個(gè)領(lǐng)域。PFOA具有難降解性，其在人體內(nèi)半衰期為5.4年[1]，通過與肝臟和血清中的蛋白相結(jié)合蓄積在機(jī)體內(nèi)，特別是處于食物鏈較高位置的物種。PFOA 具有肝臟、免疫、生殖和內(nèi)分泌等多種生物毒性[2]，對(duì)動(dòng)物及人體危害極大。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，西班牙馬德里[3]和中國深圳[4]大氣環(huán)境中均檢測(cè)出PFOA等多種PFCs的存在。室內(nèi)灰塵中曾檢測(cè)出PFOA和全氟辛烷磺?；衔?perfluorooctane sulfonate，PFOS)等多種PFCs的存在，室內(nèi)空氣中亦檢測(cè)出其揮發(fā)性的前體物質(zhì)[5]。吸附在空氣塵土表面的PFOA是人體接觸PFOA的重要途徑。相關(guān)研究表明，長(zhǎng)期接觸被PFOA污染的飲用水的人群具有更高的哮喘患病率[6]；PFCs暴露與青少年哮喘和哮喘相關(guān)的生物標(biāo)記物存在因果關(guān)聯(lián)[7]；哮喘患兒血清PFCs濃度升高會(huì)降低其肺功能[8]。可見PFCs與哮喘的關(guān)系越來越受到人們的重視，本研究在構(gòu)建哮喘小鼠模型基礎(chǔ)上，通過向哮喘小鼠氣道內(nèi)滴注不同劑量的PFOA，研究它對(duì)小鼠氣道炎癥情況的影響，并檢測(cè)外周血中炎癥因子的改變及其對(duì)肺組織糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)表達(dá)的影響，以此探討氣道PFOA暴露對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響及其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1實(shí)驗(yàn)材料

卵清蛋白(ovalbumin，OVA)及PFOA均購自Sigma；小鼠源性抗α-tubulin 單克隆抗體購自碧云天公司；抗GR-α單克隆抗體購自Abcam；其余試劑均為市售分析純。

2方法

2.1動(dòng)物分組及模型的建立 30只4～6周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠購自上海史萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為5 組(n=6)：正常對(duì)照(normal control，C)、哮喘(asthma，A)組、哮喘+PFOA 10 pg(AP10)組、哮喘+PFOA 50 pg (AP50)組和哮喘+PFOA 100 pg (AP100)組。哮喘造模分為致敏和激發(fā)2 個(gè)階段：第7天和第14天分別予0.1% OVA+Al(OH)3凝膠0.1 mL腹腔注射致敏，第21天起將各組小鼠置入有機(jī)玻璃霧化箱內(nèi)予1% OVA溶液霧化激發(fā)，每次30 min，持續(xù)7 d。正常組以生理鹽水替代。激發(fā)結(jié)束后，PFOA各組采用靜脈穿刺套管經(jīng)口進(jìn)入氣道，向小鼠氣道內(nèi)滴注含不同劑量PFOA的40 μL PBS溶液，其它組用單純PBS替代。氣管內(nèi)滴注后繼續(xù)OVA霧化激發(fā)3 d。據(jù)Liu等[4]關(guān)于深圳大氣環(huán)境中PFCs污染物相關(guān)分析的報(bào)道，深圳PFCs平均濃度15 pg/m3，其中PFOA占36%，達(dá)到5.4 pg/m3。成年小鼠的體重按30 g計(jì)算，潮氣量0.15 mL，呼吸頻率200次/min，實(shí)驗(yàn)中使用的劑量分別為10 pg、50 pg和100 pg，相當(dāng)于在上述環(huán)境中暴露約6周、30周和60周所吸入的PFOA的量。本實(shí)驗(yàn)通過本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.2動(dòng)物標(biāo)本采集 末次激發(fā)結(jié)束24 h內(nèi)，腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉溶液(8 mL/kg)麻醉后，摘除眼球留取外周血并處死，暴露胸腔后快速剪取右肺下葉，在預(yù)冷的PBS緩沖液中漂洗后，將肺組織剪碎，浸入2.5%戊二醛固定液內(nèi)，充分搖晃數(shù)次固定制作電鏡標(biāo)本。取右肺中葉漂洗后，4%多聚甲醛固定24 h、石蠟包埋、5 μm切片、HE染色后使用Olympus CX21FS-1-3倒置顯微鏡觀察氣道結(jié)構(gòu)及肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。留取剩余肺組織液氮速凍，保存于-80 ℃。

2.3ELISA法檢測(cè)外周血中白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)和干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)濃度 每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃ 40 min。用洗滌液將反應(yīng)板洗滌4～6次，濾紙上印干。每孔加入蒸餾水和 I 抗工作液各50 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃ 10 min。再次洗板。每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板置37 ℃ 10 min，再次洗板。每孔加入底物工作液100 μL，暗處37 ℃反應(yīng)15 min。每孔加入100 μL終止液混勻，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光度(A)值。

2.4Western blot法檢測(cè)GR蛋白表達(dá) 每組各稱取50～80 mg肺組織，放入含有600 μL組織裂解液的勻漿管中，常規(guī)方法提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，調(diào)整蛋白濃度至2.5 g/L，配置蛋白體系，100 ℃加熱10 min使蛋白變性，-20 ℃保存。在10% SDS-PAGE電泳膠孔道中分別加入各組蛋白20 μL，通過電泳將不同分子量的蛋白分離，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至0.45 nm的PVDF膜上，接著通過TBS平衡、脫脂牛奶封閉、TBST洗滌后， I 抗孵育過夜(抗α-tubulin工作濃度為1∶5 000，抗GR-α工作濃度為1∶1 000)。TBST洗滌、II 抗孵育、再次TBST洗滌后，將含有目的蛋白的PVDF膜置于干凈透明的玻璃板均勻滴上現(xiàn)配的ECL發(fā)光液，迅速置于曝光機(jī)中曝光，保存圖像并分析數(shù)據(jù)。

2.5免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)GR蛋白表達(dá) 將包埋好的肺組織置于二甲苯，不同濃度梯度的乙醇及PBS脫蠟水化后，置于pH 6.0枸櫞酸鹽溶液中進(jìn)行微波抗原修復(fù)，3%雙氧水室溫孵育10 min，10%的小牛血清室溫孵育30 min封閉非特異性抗原。滴加GR I 抗工作液(1∶20)，置4 ℃冰箱中孵育過夜，通用 I 抗室溫孵育30 min，PBS洗滌后，每片滴加新鮮配制的DAB顯色液顯色，自來水沖洗30 min終止顯色，置于Gill改良蘇木素復(fù)染，并依次經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0及SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理。各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性者兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett’s-T3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1小鼠生物學(xué)行為的判斷

A組及AP各組小鼠受激發(fā)后表現(xiàn)為呼吸急促、抓耳撓腮和煩躁不安等；AP50及AP100組小鼠嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)行動(dòng)遲緩和四肢癱軟的表現(xiàn)；C組小鼠表現(xiàn)不明顯，表明OVA誘導(dǎo)急性哮喘小鼠模型成功。

2PFOA加重哮喘小鼠氣道炎癥并破壞肺組織的超微結(jié)構(gòu)

HE染色結(jié)果顯示，C組小鼠氣道和肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，氣道及血管周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)未見黏液分泌；A組小鼠氣道和血管周圍及肺泡間隔炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主，氣道壁增厚，管腔變形狹窄，柱狀上皮細(xì)胞增生并分泌大量黏液；AP各組氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯，氣道明顯變形狹窄，大量黏液分泌阻塞管腔，以AP50及AP100組更為明顯，見圖1。肺組織電鏡標(biāo)本結(jié)果顯示，C組氣道上皮細(xì)胞纖毛形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整(圖2A)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞含有大量結(jié)構(gòu)致密的紡錘絲樣板層小體(圖2B)；A組可見杯狀細(xì)胞增生，肺泡Ⅱ型細(xì)胞板層小體排空樣改變，結(jié)構(gòu)疏松(圖2C黑色箭頭)，線粒體腫脹脊突消失；AP各組氣道上皮細(xì)胞變性、脫落，纖毛倒伏，結(jié)構(gòu)紊亂(圖2D)，板層小體大量排空(圖2E黑色箭頭)，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹變形(圖2E白色箭頭)，AP100組可見吞噬PFOA顆粒的巨噬細(xì)胞(圖2F)。

Figure 1. The pathological changes of the lung tissues in the mice exposed to PFOA at different concentrations (HE staining).

圖1各組小鼠肺組織病理改變

Figure 2. The ultrastructural changes of the lung tissue in the mice exposed to PFOA at different concentrations observed under transmission electron microscope. A: cilia of normal cell (black arrow)； B: compact lamellar body (black arrow)； C: loose lamellar body (black arrow)； D: disorderly cilia (black arrow)； E: loose lamellar body (black arrow) and swollen organelle(white arrow)； F: PFOA engulfed by macrophages (black arrow).

圖2各組小鼠肺組織透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)改變

3氣道PFOA暴露升高哮喘小鼠外周血IL-4水平，降低IFN-γ水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與C組相比，A組與AP各組血清IL-4水平升高，IFN-γ水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組、AP10組與AP50組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而與A組相比，AP100組IL-4水平升高，IFN-γ水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

4哮喘及PFOA暴露對(duì)小鼠GR蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與C組相比，A組和AP各組GR蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而A組與AP各組之間的GR蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。免疫組化結(jié)果顯示，GR主要表達(dá)于支氣管柱狀上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞胞漿，胞核表達(dá)較少；與C組相比，A組氣道上皮細(xì)胞胞漿及胞核GR表達(dá)不明顯，血管平滑肌細(xì)胞GR少量表達(dá)；AP各組胞漿及胞核GR表達(dá)減少，特別是AP100組，GR表達(dá)不明顯，見圖5。

討 論

PFOA作為有代表性的一種PFCs，其對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響不容忽視。有相關(guān)出生隊(duì)列研究表明，孕婦產(chǎn)前PFOA和PFOS暴露與胎兒臍帶血中IgE水平的升高呈正相關(guān)[9]，提示孕期PFOA暴露可通過升高胎兒血清IgE水平影響胎兒的免疫功能。皮膚PFOA接觸暴露可加劇OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)，同時(shí)升高血清IgE水平，并且加劇氣道對(duì)OVA及其它致敏原的反應(yīng)性[10]。IL-4是Th2分泌的特征性細(xì)胞因子之一，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)IgE的合成和分泌，是抗原引起炎癥細(xì)胞活化聚集、氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生及黏液過度分泌的基礎(chǔ)。多項(xiàng)研究證實(shí)IL-4水平在小鼠急性哮喘模型中分泌量增加[11]。IFN-γ主要來源于Th1細(xì)胞，同時(shí)可促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，對(duì)Th2細(xì)胞的分化和功能有抑制作用。Dong等[12]的研究表明，PFCs可誘導(dǎo)Th1/Th2免疫平衡向Th2方向分化，通過促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答加劇炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示哮喘小鼠血清炎癥因子IL-4水平增加，血清IFN-γ水平降低；PFOA高劑量暴露的哮喘小鼠與單純哮喘小鼠相比IL-4水平增加，IFN-γ水平降低，提示PFOA可能通過抑制哮喘小鼠Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答來加劇哮喘小鼠的氣道炎癥，且該作用與劑量相關(guān)。而Ryu等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎期及新生期的長(zhǎng)期慢性飲食PFOA暴露可引起新生小鼠氣道反應(yīng)性增加，同時(shí)加劇肺部炎癥反應(yīng)，肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞以及IFN-γ均明顯升高，提出PFOA可能介導(dǎo)不同于哮喘的Th1型免疫應(yīng)答。這可能是PFOA的急性暴露和長(zhǎng)期慢性暴露以及PFOA暴露的總量使機(jī)體產(chǎn)生的反應(yīng)有所不同，潛在的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。本研究肺組織病理結(jié)果亦提示PFOA加劇氣道炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，黏液分泌增多，這與外周血炎癥因子表達(dá)結(jié)果一致。

Figure 3. The serum concentrations of IL-4 and IFN-γ in the mice exposed to PFOA at different concentrations. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (C) group;△P<0.05vsasthma (A) group.

圖3各組小鼠血清IL-4及IFN-γ濃度的變化

Figure 4. The protein expression of GR in the lung tissues of the mice exposed to PFOA at different concentrations determined by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (C) group.

圖4Westernblot法檢測(cè)各組小鼠肺組織GR表達(dá)

Figure 5. The protein expression of GR in the lung tissues of the mice exposed to PFOA at different concentrations observed by immunohistochemical staining.

圖5免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組小鼠肺組織GR表達(dá)

內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的抗炎效應(yīng)與有活性的糖皮質(zhì)激素的濃度相關(guān)，也與GR的結(jié)構(gòu)和密度相關(guān)。GR激活并進(jìn)入胞核作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用可能的機(jī)制包括：(1)與SLPI、MKP-1和GILZ等糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件結(jié)合促進(jìn)抗炎基因的轉(zhuǎn)錄[14]；(2)與CBP結(jié)合抑制NF-κB等炎癥細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的功能[15]；(3)增加TTP的表達(dá)來抑制TNF-α等炎癥因子的表達(dá)[16]。GR表達(dá)的升高被視為一種抗炎和保護(hù)作用，OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺組織GR表達(dá)降低已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)，通過運(yùn)動(dòng)等方法提高GR表達(dá)可能起到改善哮喘的作用[17]。相關(guān)研究表明IL-4能夠抑制外周血單核細(xì)胞中的GR向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移[18]，可能促進(jìn)哮喘等Th2型免疫反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。本研究用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織GR的表達(dá)明顯低于正常小鼠，而PFOA暴露對(duì)GR蛋白表達(dá)無明顯影響。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果亦提示GR蛋白表達(dá)在支氣管上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)較多，哮喘小鼠蛋白表達(dá)明顯低于正常小鼠，PFOA暴露小鼠與哮喘小鼠無明顯差異。GR在幾乎所有細(xì)胞內(nèi)都有表達(dá)，但在不同組織、不同細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的亞型不同[19]。這可能是因?yàn)樵谏鲜鯬FOA劑量范圍內(nèi)小鼠吸入的量不足以影響GR的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠氣道PFOA急性暴露可通過誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)加劇肺部炎癥，促進(jìn)氣道及血管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并破壞肺組織超微結(jié)構(gòu)，其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。盡管目前研究報(bào)道PFCs的蓄積性和毒性不強(qiáng)[20]，但進(jìn)入大氣環(huán)境的PFOA可遠(yuǎn)距離進(jìn)行遷移或轉(zhuǎn)運(yùn)，危害大，特別是PFOA和PFOS的暴露已成為公眾健康關(guān)注的重點(diǎn)。PFCs在不同的區(qū)域和介質(zhì)中的污染水平不同，但可以肯定的是其在全球范圍內(nèi)已廣泛存在。大氣環(huán)境中的PFOA對(duì)哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的影響已引起廣泛關(guān)注，值得更多深入的研究。

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