復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊對兔腹主動脈再狹窄模型血脂及炎癥因子的影響*

張仁丹， 黎土娣， 王加偉， 鄧惠堅， 曾智桓

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510080)

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)作為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)血運(yùn)重建的主要治療方式之一，可明顯降低冠心病的死亡率，但術(shù)后血管再狹窄發(fā)生率高極大的限制了PCI術(shù)的臨床療效[1]。血管再狹窄的發(fā)生涉及不同程度的血管彈性回縮、內(nèi)膜增厚、血管重塑、炎癥及平滑肌細(xì)胞遷移和增殖等多項機(jī)制[2]。PCI術(shù)中球囊擴(kuò)張或支架展開后，使血管內(nèi)皮細(xì)胞表面破壞和剝脫，引起一系列的炎癥介質(zhì)和趨化因子釋放等炎癥級聯(lián)反應(yīng);炎癥反應(yīng)的發(fā)生被認(rèn)為是再狹窄的始動因素;因此，如何有效抑制炎癥，是防止PCI術(shù)后再狹窄的關(guān)鍵[3]。有研究證實，PCI術(shù)后血脂高的患者再狹窄的發(fā)生率較高，心絞痛的復(fù)發(fā)時間與高脂血癥密切相關(guān)，而且血脂控制不良可加速血管壁炎癥進(jìn)展[4]。復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊(Fufang Zhenzhu Tiaozhi capsule，F(xiàn)TZ)依據(jù)中醫(yī)藥學(xué)理論進(jìn)行組方，由女貞子、白術(shù)、丹參、三七和黃連等8味中藥組成，可通過多途徑、多靶點綜合調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，治療高脂血癥和脂代謝紊亂相關(guān)疾病。前期臨床實踐和實驗研究發(fā)現(xiàn)，該方有明顯降低總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及升高高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)的作用，可抑制動脈粥樣硬化的形成[5]。本文主要通過建立動脈粥樣硬化模型及血管球囊成形術(shù)后再狹窄模型，探索FTZ治療對模型動物血脂及炎癥因子的影響，明確FTZ是否通過降低血脂水平和抑制核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路調(diào)控各種炎癥因子起到治療再狹窄的作用。

材 料 和 方 法

1實驗動物

新西蘭大白兔30只，雌雄不拘，體質(zhì)量(2.0±0.2)kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號為SYXK(粵)2012-0125。飼料均購自于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,許可證號SYXK(粵)2013-0002。分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，120 g·kg-1· d-1定量喂食，高脂飼料(配方為1.5%的膽固醇、0.5%的膽鹽、8%的豬油和10%的蛋黃粉)以60 g·kg-1·d-1喂養(yǎng)，自由飲水。觀察一般精神狀況、飲食、皮毛、肥胖程度及有無腹瀉等。

2主要藥物及試劑

復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊(批號為20160603，由廣東藥科大學(xué)藥物研究所提供)；阿托伐他汀鈣片(批號H20051408，輝瑞制藥有限公司)；ELISA試劑盒(批號XO7015918和EI6015917，武漢華美生物工程有限公司)；抗NF-KB p65多克隆抗體(批號SA2318595，Thermo Fisher)。

3主要儀器

Artis zee III ceiling數(shù)字減影X射線機(jī)(Siemens)； 橈動脈穿刺包(包括穿刺套管針、細(xì)超滑鋼絲和6F 橈動脈鞘，TERUMO)；經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)球囊(Metronic)；7108ISE型全自動生化分析儀(HITACHI)；高倍顯微鏡(Olympus)。

4實驗方法

4.1分組與模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組6只，即空白對照(blank control)組、再狹窄模型(restenosis)組、FTZ 組(0.66 g·kg-1·d-1)、阿托伐他汀(5 mg·kg-1·d-1)組及FTZ 和阿托伐他汀聯(lián)合用藥組。

4.1.1動脈粥樣硬化模型制備 按照文獻(xiàn)提供方法[6]，除空白對照組外，其它4組均行以下操作，用戊巴比妥鈉以1 mL/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定，采用TERUMO橈動脈穿刺包穿透法成功穿刺股動脈后輕柔地進(jìn)入導(dǎo)絲，沿導(dǎo)引鋼絲插入6F(1F=0.33 mm)橈動脈鞘管，取動脈血10 mL，檢測血脂，并用ELISA法檢測細(xì)胞因子，300 U肝素抗凝，在數(shù)字減影X射線機(jī)下，經(jīng)動脈鞘管注入碘海醇注射液行動脈造影。再沿鞘送入Sprinter球囊(3.0 mm×20 mm)至腹主動脈，用303.975 kPa充盈球囊，在腹主動脈上下牽拉3次，充分剝離腹主動脈內(nèi)皮。傷口用紗布卷加壓包扎，大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射青霉素鈉(8×105U/d)，注射3 d。繼續(xù)高脂飼養(yǎng)4周?？瞻讓φ战M實驗步驟同上，但不予球囊損傷。

4.1.2腹主動脈球囊成形術(shù)建立再狹窄模型 高脂飼養(yǎng)4周后，再次采用上述方法麻醉、固定動物并穿刺股動脈，采動脈血檢測血脂，并用ELISA法檢測細(xì)胞因子，沿鞘送入球囊至腹主動脈，用607.95 kPa充盈球囊擴(kuò)張腹主動脈損傷處，每次擴(kuò)張30 s，擴(kuò)張3次。傷口用紗布卷加壓包扎，大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射青霉素鈉(8×105U/d)，注射3 d。各服藥組灌胃服用相應(yīng)藥物(1%的羧甲基纖維素鈉溶液溶解阿托伐他?。籉TZ配成相應(yīng)濃度的混懸液；模型組灌服1%羧甲基纖維素溶液)后，均予普通飼料飼養(yǎng)4周。最后再采用上述方法麻醉、固定及穿刺股動脈，采動脈血檢測血脂，并用ELISA法檢測細(xì)胞因子，取腹主動脈備用。

4.2血管造影血管狹窄分析 使用數(shù)字減影X射線機(jī)主機(jī)自帶的二維定量冠脈造影原廠工作站對造影結(jié)果中2幅不同角度的造影圖片進(jìn)行定量分析，主要測量：(1)靶血管在不同投照角度的長度(取較充分暴露血管病變和沒有明顯短縮的為二維靶血管長度)；(2)參考血管直徑(reference vessel diameter，RVD；病變近段直徑與遠(yuǎn)段直徑之和均數(shù))；(3)直徑狹窄率[即最小管腔直徑(minimum lumen diameter，MLD)百分比，MLD%]=(1-MLD/RVD)×100%(2幅投照角度直徑狹窄率之和均數(shù))；(4)面積狹窄率[即最小管腔面積(minimum lumen area, MLA)百分比，MLA%]=(1-MLA/參考管腔面積)×100%(2幅投照角度面積狹窄率之和均數(shù))[7]。

4.3血清學(xué)指標(biāo)的測定 取上述實驗血標(biāo)本5 mL，予全自動生化分析儀測定血清LDL-C、HDL-C、極低密度脂蛋白膽固醇(very-low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)、TC和TG濃度。另取血標(biāo)本5 mL，靜置30 min后3 000 r/min 離心10 min后取血清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書步驟測定NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)、白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的含量。

4.4免疫組織化學(xué)染色 腹主動脈取材后，用生理鹽水洗去血液，4%甲醇固定1 d后脫水，包埋蠟塊，切片行免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色陽性表達(dá)的細(xì)胞顯微鏡下觀察為棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片隨機(jī)選擇10個視野(×400)觀察，NF-κB染色強(qiáng)度用平均吸光度(A)表示，使用Image-Pro Plus 軟件分析。

5統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0的軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, 實驗數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，組間均數(shù)比較在方差齊時用單因素方差分析，方差不齊時用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1實驗動物的一般情況

在整個實驗過程中，各組動物的體質(zhì)量逐漸增加。為預(yù)防腹瀉，每天以酵母片0.2 g喂食。本實驗納入新西蘭兔30只，共 5 組，均順利完成實驗，進(jìn)入結(jié)果分析。

2動脈粥樣硬化模型和再狹窄模型的建立

與第1次血管造影相比，第2次血管造影球囊擴(kuò)張前MLD%和MLA%顯著升高(P<0.01)，表明球囊損傷結(jié)合高脂飲食成功建立動脈粥樣硬化模型；經(jīng)球囊擴(kuò)張治療后，與第2次血管造影球囊擴(kuò)張后相比，第3次手術(shù)中模型組的MLD%及MLA%顯著升高(P<0.01)，表明動脈再狹窄模型成功建立，見圖1、表1。

Figure 1. The angiographic images during modeling.

圖1模型建立過程中的血管造影圖像

表1 模型建立過程中的 MLD%和MLA%分析結(jié)果

**P<0.01vsfirst abdorminal aortic angiography;##P<0.01vssecond angiography after balloon dilatation.

3FTZ對兔腹主動脈造影成形術(shù)后血管的影響

與空白對照組相比，再狹窄模型組MLD%及MLA%顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，F(xiàn)TZ治療組、阿托伐他汀治療組及聯(lián)合用藥組的MLD%及MLA%均明顯下降(P<0.01)；但各用藥組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，表明FTZ和阿托伐他汀均能明顯改善球囊成形術(shù)后再狹窄的狀況，抑制內(nèi)膜增生，見圖2、表2。

4FTZ對兔腹主動脈成形術(shù)后血脂的影響

與空白對照組相比，再狹窄模型組血清的TC、TG、HDL-C、LDL-C和VLDL-C濃度顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與再狹窄模型組相比，F(xiàn)TZ組、阿托伐他汀組和聯(lián)合用藥組TC、LDL-C和VLDL-C濃度均顯著降低(P<0.01)，聯(lián)合用藥組HDL-C明顯升高(P<0.05)，各組間的TG濃度差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，表明FTZ和阿托伐他汀均能降低血脂水平，且2種藥物聯(lián)合用藥時有升高HDL-C作用；與阿托伐他汀組相比，F(xiàn)TZ組TC、TG、LDL-C和VLDL-C濃度的差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，表明FTZ與阿托伐他汀降低血脂的療效相當(dāng)；分別與FTZ組和阿托伐他汀組相比，聯(lián)合用藥組TC、LDL-C和VLDL-C均顯著降低(P<0.05)， HDL-C的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，表明FTZ和阿托伐他汀聯(lián)合用藥時降低血脂的作用更加明顯，見表3。

Figure 2. Rabbit abdominal aorta angiography analysis of vascular stenosis in each group.

圖2各組兔腹主動脈血管造影分析血管狹窄情況

表2各組MLD%和MLA%分析結(jié)果

Table 2. Comparison of the abdominal aortic stenosis in each group (%. Mean±SD.n=6)

GroupMLD%MLA%Blankcontrol2．66±1．035．50±2．43Restenosis33．67±8．52??57．17±9．62??FTZ10．17±4．16##12．83±3．43##Atorvastatin9．33±4．67##16．33±7．00##Atorvastatin+FTZ7．00±1．67##20．66±5．64##

**P<0.01vsblank control group;##P<0.01vsrestenosis group.

表3 各組血脂的比較

*P<0.05,**P<0.01vsblank control group;##P<0.01vsrestenosis group,&P<0.05vsFTZ group；△P<0.05vsatorvastatin+FTZ group.

5FTZ對兔腹主動脈成形術(shù)后細(xì)胞因子的影響

與空白對照組相比，再狹窄模型組的IL-1和MCP-1含量顯著升高(P<0.01)，IκB明顯降低(P<0.05)，表明再狹窄模型組中存在明顯的炎癥反應(yīng)；與再狹窄模型組相比，F(xiàn)TZ組、阿托伐他汀組和FTZ +阿托伐他汀組血清中IL-1和MCP-1的含量顯著降低(P<0.01)，各組間IκB的含量無顯著差異，表明FTZ與阿托伐他汀均有顯著抑制炎癥反應(yīng)的作用；與阿托伐他汀組相比，F(xiàn)TZ組IL-1和MCP-1含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，表明FTZ與阿托伐他汀抑制炎癥反應(yīng)的效果相當(dāng)；分別與FTZ組和阿托伐他汀組相比，聯(lián)合用藥組IL-1顯著降低(P<0.05)，表明兩者聯(lián)合用藥時可能對抑制炎癥反應(yīng)的效果更顯著，見表4。

表4 各組炎癥因子的比較

*P<0.05,**P<0.01vsblank control group;##P<0.01vsrestenosis group；△P<0.05vsatorvastatin+FTZ group.

6腹主動脈免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

再狹窄模型組中NF-κB表達(dá)顯著高于空白對照組及各治療組(P<0.01)，表明與空白對照組相比，再狹窄模型組中炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的內(nèi)膜增生明顯，與模型組相比，各用藥組均有抑制炎癥反應(yīng)，從而抑制內(nèi)膜增生；FTZ組與阿托伐他汀組NF-κB表達(dá)未見明顯差異(P>0.05)，表明FTZ與阿托伐他汀抑制內(nèi)膜增生作用的效果相當(dāng)；聯(lián)合用藥組較單用藥組NF-κB表達(dá)明顯減少(P<0.05)，表明FTZ與阿托伐他汀聯(lián)合用藥有更強(qiáng)的抑制內(nèi)膜增生作用，見圖3。

Figure 3. The results of immunohistochemical staining for determining the expression of nuclear factor-κB in rabbit arota in each group (×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank control group；#P<0.05vsrestenosis group；△P<0.05vsatorvastatin+FTZ group.

圖3各組兔腹主動脈NF-κB表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果

討 論

PCI術(shù)后再狹窄的高發(fā)生率明顯限制了其臨床療效，現(xiàn)研究認(rèn)為再狹窄的主要病理基礎(chǔ)是PCI術(shù)后引起的血管內(nèi)膜的剝脫損傷，導(dǎo)致中膜血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和遷移、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)大量積聚及新生內(nèi)膜增生[8]。動脈粥樣化形成的第一階段的特征在于內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，該病變導(dǎo)致循環(huán)中起免疫防御能力的炎癥細(xì)胞，通過復(fù)合信號級聯(lián)反應(yīng)被招募到損傷的內(nèi)皮表面，從而內(nèi)皮細(xì)胞開始表達(dá)其表面黏附分子等相關(guān)因子[9]。單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁已被視為動脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵步驟，激活的單核細(xì)胞可改變細(xì)胞功能，出現(xiàn)黏附和增殖等炎癥反應(yīng)的特征。PCI術(shù)中球囊擴(kuò)張或支架展開后，使血管內(nèi)皮損傷剝脫、斑塊壓碎，致斑塊內(nèi)炎癥介質(zhì)和化學(xué)趨化因子釋放。釋放的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)可誘導(dǎo)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向損傷部位趨化，血管內(nèi)膜表面吸附了大量的單核細(xì)胞和白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，誘發(fā)了早期的炎癥反應(yīng)。隨后，巨噬細(xì)胞浸潤血管內(nèi)膜并圍繞損傷部位聚集成簇，聚集于損傷部位的血小板、巨噬細(xì)胞及組織細(xì)胞分泌大量趨化因子、生長因子誘導(dǎo)VSMCs從中膜遷移入內(nèi)膜，VSMCs大量增殖，不斷的產(chǎn)生細(xì)胞因子、生長因子和ECM，最終導(dǎo)致新生內(nèi)膜的增生[10]。本研究比較了各實驗組第1次球囊擴(kuò)張與第2次球囊擴(kuò)張前的MLD%和MLA%，及第2次球囊擴(kuò)張后及第3次血管造影的指標(biāo)，差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明成功建立了動脈粥樣硬化模型及腹主動脈球囊成形術(shù)再狹窄模型。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)FTZ對動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)兔有抗脂質(zhì)過氧化及保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用，這可能是其抗AS作用的機(jī)制之一。韋燕萍[5]等也證明FTZ可通過恢復(fù)肝酯酶活性，加快清除血液中的脂蛋白殘粒，降低血漿中的甘油三酯，同時對HDL代謝也進(jìn)行調(diào)節(jié)，使HDL-C回升，從而發(fā)揮其抗動脈硬化作用[11]。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)FTZ和阿托伐他汀治療后，與再狹窄模型組相比，其血脂濃度出現(xiàn)明顯改變，表現(xiàn)為TC、TG和LDL-C下降，HDL-C有所升高，F(xiàn)TZ的降脂作用與上述報道相符。高脂血癥在再狹窄中起重要作用，PCI術(shù)后血脂的良好控制是防止再狹窄的目標(biāo)之一。本實驗通過FTZ與阿托伐他汀對比，結(jié)果表明FTZ有降低血脂從而發(fā)揮預(yù)防再狹窄的作用。

在內(nèi)皮剝脫后早期，炎癥細(xì)胞如MCP-1就會發(fā)生浸潤，并進(jìn)一步刺激單核細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致再狹窄；IL-1由粥樣斑塊內(nèi)激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)VSMCs增殖和向粥樣斑塊和內(nèi)皮細(xì)胞招募更多炎性細(xì)胞[1]；NF-κB作為真核細(xì)胞中普遍存在的一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控許多生物反應(yīng)過程，有研究證明其是重要的促動脈粥樣硬化因子，可調(diào)控動脈粥樣硬化所有過程階段的基因[12]。激活NF-κB可以通過調(diào)節(jié)MCP-1等基因的表達(dá)來促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，通過抑制NF-κB通路，血管損傷后新生內(nèi)膜形成減少[13]?？梢?，NF-κB的產(chǎn)生可加速再狹窄的進(jìn)程，本實驗結(jié)果也顯示，與對照組相比，再狹窄模型組血清中NF-κB靶基因表達(dá)產(chǎn)物如IL-1和MCP-1等相應(yīng)增高，表明球囊損傷后，NF-κB被激活且引起了一系列靶基因的激活，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。且經(jīng)免疫組化驗證，NF-κB在組織表達(dá)量模型組較空白對照組明顯升高，而用藥組都相應(yīng)的減少NF-κB的表達(dá)量，表明FTZ可能通過抑制NF-κB通路，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，從而減少球囊損傷術(shù)后炎癥反應(yīng)引起的內(nèi)膜損傷，抑制血管成形后再狹窄。

總而言之，血管內(nèi)皮損傷和炎癥反應(yīng)是PCI術(shù)后血管再狹窄的重要病理生理機(jī)制，控制血脂水平、抑制炎癥反應(yīng)是防治PCI術(shù)后再狹窄的重要策略。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ對兔腹主動脈再狹窄模型有降低血脂并抑制炎癥反應(yīng)的作用，而且FTZ的作用機(jī)制可能與抑制NF-κB從而調(diào)節(jié)炎癥因子有關(guān)。不僅如此，結(jié)合血脂及細(xì)胞因子檢測，F(xiàn)TZ聯(lián)合阿托伐他汀抑制再狹窄的效果比單用藥物更加顯著，該點可為中西醫(yī)結(jié)合治療動脈粥樣硬化及PCI術(shù)后內(nèi)膜增生提供理論及實驗依據(jù)。

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