干擾Yes相關蛋白表達調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響膀胱癌細胞凋亡*

劉邦儉， 王 琦， 于德新△， 趙 韌

(1安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科， 安徽 合肥 230601； 2太和縣第二人民醫(yī)院泌尿外科， 安徽 太和 236600； 3安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 安徽 合肥 230022)

膀胱癌是一種泌尿系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率在尿路上皮腫瘤中超過95%[1]。手術治療及化學藥物灌注等常見的治療手段雖然取得了一定的效果，但膀胱癌患者中仍然有高達30%左右的患者出現(xiàn)復發(fā)[2-3]?；虬邢蛑委熓悄壳爸委熌[瘤的一種重要技術手段，具有針對性強和副作用小等優(yōu)點，尋找有效的靶基因治療膀胱癌是目前的研究重點。Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)能夠調(diào)控細胞內(nèi)信號傳導和基因的轉(zhuǎn)錄過程，屬于連接蛋白和轉(zhuǎn)錄共啟動因子，參與腫瘤的發(fā)生過程[4-6]。有研究表明，YAP在食管鱗癌、前列腺癌、胃癌、肺癌和肝癌等組織中表達升高，敲低YAP表達后的前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌和胃癌等多種癌細胞的生長受到抑制，細胞凋亡增加[7-10]。也有研究表明，YAP在膀胱癌中表達升高[11]。Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤組織中過度激活，用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535抑制其激活后能夠促進腫瘤細胞凋亡[12]。本研究以膀胱癌細胞為研究對象，探討YAP對膀胱癌細胞生長及凋亡的影響，以期為治療膀胱癌提供新思路。

材 料 和 方 法

1材料

膀胱癌細胞T-24購自安徽生物細胞中心。Lipofectamine 2000購自Invitrogen；小干擾RNA陰性對照(small interfering RNA negative control，siRNA-NC)和YAP小干擾RNA(YAPsiRNA)購自上海愛丁堡生物科技發(fā)展有限公司；YAP和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物均由上海英駿生物技術有限公司合成；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)定量檢測試劑盒購自于天根生化科技(北京)有限公司；Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535購自Sigma；抗β-catenin單克隆抗體、抗c-Myc單克隆抗體和抗YAP單克隆抗體購自Cell Signaling Technology。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 膀胱癌細胞T-24分為正常對照(control)組、siRNA-NC組和YAPsiRNA組，siRNA-NC組和YAPsiRNA組細胞分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC和YAPsiRNA，control組為不轉(zhuǎn)染的細胞。將膀胱癌細胞T-24接種到6孔細胞培養(yǎng)板中(接種密度為1×109/L)，觀察細胞融合度達到60%時，依照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行細胞轉(zhuǎn)染。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

2.2Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中YAP的mRNA表達水平 各組細胞培養(yǎng)48 h后，加入1 mL Trizol(每106個細胞加1 mL)，裂解反應10 min，加1 mL的三氯甲烷溶液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取400 μL的上層水相層溶液與等體積的異丙醇混合后，靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清，用75%的乙醇溶液洗滌2次后，在室溫下自然晾干，用紫外分光光度計檢測提取的RNA的濃度及純度。Real-time PCR檢測YAP表達，程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。YAP的上游引物序列為5’-ACCACAGCTCAGCATCTTCG-3’，下游引物序列為5’-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列為5’-GGAGTGTTGGAGAAGTCATATAC-3’。以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計算YAP的mRNA表達水平。

2.3Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后細胞中YAP的蛋白表達水平 Control組、siRNA-NC組和YAPsiRNA組細胞培養(yǎng)48 h后，加入蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min后，14 000 r/min，4 ℃離心20 min，將蛋白上清轉(zhuǎn)移到EP管中。用BCA法對蛋白樣品進行定量，步驟參照BCA蛋白定量檢測試劑盒。將蛋白樣品與等量的2×Loading Buffer混合煮沸5 min。10%分離膠和5%濃縮膠進行凝膠電泳，每孔上樣量為50 μL。在濃縮膠中用90 V電壓電泳，在分離膠中用120 V電壓電泳。4 ℃將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，依次與 I 抗(800倍稀釋，4 ℃過夜)和 II 抗(1 000倍稀釋，室溫1 h)孵育后，顯色，以GAPDH為內(nèi)參照，分析YAP的蛋白水平。

2.4MTT法檢測細胞活力 Control組、siRNA-NC組和YAP siRNA組以每孔3×103個細胞接種到96孔板中，細胞懸浮液體積為100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組7個復孔，以不加細胞的孔調(diào)零。48 h后在每孔中加入20 μL MTT (5 g/L)溶液，37 ℃孵育4 h，吸除上清液，加入150 μL的二甲基亞砜，反應10 min后，酶標儀檢測490 nm每孔的吸光度(A)。

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 Control組、siRNA-NC組和YAPsiRNA組細胞培養(yǎng)48 h后，用胰蛋白酶消化，離心后，加入適量預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)，使細胞濃度為1×109/L。收集1 mL的細胞，用冰預冷的PBS洗滌細胞2次，加入結(jié)合緩沖液，依次加入5 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)和膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC，避光反應25 min，加入400 μL的結(jié)合緩沖液，用流式細胞術檢測細胞凋亡。

2.6Western blot法檢測β-catenin和c-Myc的蛋白表達 Control組、siRNA-NC組和YAPsiRNA組細胞培養(yǎng)48 h，收集細胞蛋白，Western blot檢測細胞中β-catenin和c-Myc表達水平，步驟參照2.3。

2.7Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535對細胞活力及凋亡的影響 將轉(zhuǎn)染YAPsiRNA后的膀胱癌細胞T-24用20 μmol/L的Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535作用48 h，記為YAPsiRNA+FH535組，用MTT法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western blot檢測β-catenin和c-Myc的蛋白表達水平，步驟參照2.4、2.5和2.6。

3統(tǒng)計學處理

所得的實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1轉(zhuǎn)染后細胞中YAP表達水平的變化

Real-time PCR結(jié)果顯示，YAPsiRNA組的YAP mRNA水平和蛋白水平均明顯低于control組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The expression of YAP at mRNA (A) and protein (B) levels in transfected T-24 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1轉(zhuǎn)染后細胞中YAP表達水平

2YAP對細胞活力的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，YAPsiRNA組的細胞活力明顯低于control組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effect of YAP on the viability of transfected T-24 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2YAP對細胞活力的影響

3YAP對細胞凋亡的影響

流式細胞術結(jié)果顯示，YAPsiRNA組的細胞凋亡率明顯高于control組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

4YAP對細胞中β-catenin和c-Myc蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，YAPsiRNA組的β-catenin和c-Myc明顯低于control組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

5Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535對細胞活力的影響

如圖5所示，YAPsiRNA+FH535組細胞中的c-Myc和β-catenin的水平均低于YAPsiRNA組；YAPsiRNA+FH535組細胞活力也明顯低于YAPsiRNA組(P<0.05)，見圖5。

6Wnt/β-catenin信號通路抑制劑對細胞凋亡的影響

流式細胞術結(jié)果顯示，YAPsiRNA+FH535組的細胞凋亡率明顯高于YAPsiRNA組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

討 論

YAP基因編碼一個65 kD的含有脯氨酸的蛋白分子，該蛋白含有2個WW結(jié)構域(這種結(jié)構域包含35～40個氨基酸)，是Hippo信號通路的核心蛋白[13]。Liu等[14]通過免疫組化的方法檢測了宮頸癌組織和正常宮頸組織中YAP的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YAP在宮頸癌組織中的表達水平升高，并且與宮頸癌的臨床分期有關。張寧南等[15]收集了膀胱癌及對應的癌旁組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中YAP mRNA和蛋白水平均明顯高于癌旁組織，而通過siRNA干擾T40細胞中YAP的表達之后，T40細胞S期細胞比例下調(diào)，細胞遷移能力下降。本研究結(jié)果顯示，干擾YAP表達后的膀胱癌細胞活力下降，細胞凋亡增多。這與之前的研究報道相符，均表明干擾YAP能夠發(fā)揮抑制癌癥發(fā)展的作用。

Figure 3. The effect of YAP on the apoptosis of transfected T-24 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3YAP對細胞凋亡的影響

Figure 4. The effect of YAP on the protein expression of β-catenin and c-Myc in transfected T-24 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4YAP對細胞中β-catenin和c-Myc蛋白表達的影響

Wnt/β-catenin信號通路在機體肺臟和肝臟等組織器官的細胞中廣泛存在，不僅參與細胞的生長過程，還參與心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和腦血管等疾病的發(fā)生[16]。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵蛋白，而c-myc是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因[17]。近年來的研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤組織中過度活化[18]。Chen等[19]檢測了不同宮頸癌組織中β-catenin的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin在宮頸癌組織中的表達水平升高，并且在HeLa、SiHa和CaSki細胞中的表達水平明顯高于正常的相對表達量。Pierzynski等[20]運用免疫組化的方法檢測發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路的啟動子在膀胱癌中的陽性表達率為71%，而在正常的癌旁組織中陽性表達率為30%。萬雪蓮等[21]發(fā)現(xiàn)激活膀胱癌細胞中Wnt信號通路能夠逆轉(zhuǎn)肝細胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule，HepaCAM)對膀胱癌細胞的增殖抑制作用。這些結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號通路參與多種膀胱癌細胞的多種生物學特性調(diào)控生長過程，該信號通路的活性高低直接影響細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。

Figure 5. The viability of transfected T-24 cells exposed to the Wnt/β-catenin signaling pathway inhibitor FH535. A: the result of Western blot for detecting the protein expression levels of β-catenin and c-Myc; B: the cell viability after exposure to FH535 measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsYAPsiRNA group.

圖5Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535作用后細胞活力的變化

Figure 6. The changes of apoptosis of transfected T-24 cells after exposed to the Wnt/β-catenin signaling pathway inhi-bitor FH535. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsYAPsiRNA group.

圖6Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535作用后細胞凋亡情況

YAP是Hippo信號通路的關鍵調(diào)控蛋白，也是Hippo信號通路下游核心轉(zhuǎn)錄激活因子，其激活后可以調(diào)控與細胞增殖和凋亡相關的靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤進一步發(fā)生[22]。而Wnt信號通路也是通過作用于β-catenin，使β-catenin進入到細胞核內(nèi)，通過與TCF/LEF結(jié)合，從而激活下游與細胞增殖相關的靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤發(fā)生[23]。在遺傳學上，Hippo通路與Wnt通路可以相互作用，而其具體的作用機制尚不清楚[24]。YAP基因含有一個TEAD結(jié)合區(qū)，該區(qū)域可以同β-catenin的N端特異性結(jié)合，導致β-catenin在細胞漿內(nèi)聚集，抑制Wnt通路的激活；另外，YAP基因還可以與Dvl相結(jié)合，抑制β-catenin的核定位，導致Wnt信號通路功能受阻[25-26]。還有研究報道稱，β-catenin也可以同YAP的啟動子相結(jié)合，調(diào)控YAP蛋白的表達[27]。

本研究結(jié)果顯示，干擾YAP表達后膀胱癌細胞中β-catenin和c-Myc表達水平下降，而進一步抑制Wnt信號通路的激活能夠協(xié)同干擾YAP對膀胱癌細胞的生長抑制和凋亡促進作用。這提示，干擾YAP表達能夠通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活而促進膀胱癌細胞的凋亡，并抑制膀胱癌細胞生長。本研究結(jié)果為進一步探討YAP在膀胱癌發(fā)病機制中的作用奠定了基礎，為靶向YAP治療膀胱癌提供理論基礎。

[1] Choi W, Porten S, Kim S, et al. Identification of distinct basal and luminal subtypes of muscle-invasive bladder cancer with different sensitivities to frontline chemotherapy[J]. Cancer cell, 2014, 25(2):152-165.

[2] 陳奇彪, 詹雄宇, 呂秀秀, 等. 小檗堿增強阿霉素誘導的膀胱癌 T24 細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(5):847-851.

[3] Powles T, Eder JP, Fine GD, et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer[J]. Nature, 2014, 515(7528):558-562.

[4] Zhou Z, Zhu JS, Gao CP, et al. siRNA targetingYAPgene inhibits gastric carcinoma growth and tumor metastasis in SCID mice[J]. Oncol Lett, 2016, 11(4):2806-2814.

[5] Cao JJ, Zhao XM, Wang DL, et al.YAPis overexpressed in clear cell renal cell carcinoma and its knockdown reduces cell proliferation and induces cell cycle arrest and apoptosis[J]. Oncol Reports, 2014, 32(4):1594-1600.

[6] Sheng X, Li WB, Wang DL, et al. YAP is closely correlated with castration-resistant prostate cancer, and downregulation of YAP reduces proliferation and induces apoptosis of PC-3 cells[J]. Mol Med Reports, 2015, 12(4):4867-4876.

[7] Moroishi T, Hansen CG, Guan KL. The emerging roles of YAP and TAZ in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2015, 15(2):73-79.

[8] Calvo F, Ege N, Grande-Garcia A, et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts[J]. Nat Cell Biol, 2013, 15(6): 637-646.

[9] Touil Y, Igoudjil W, Corvaisier M, et al. Colon cancer cells escape 5FU chemotherapy-induced cell death by entering stemness and quiescence associated with the c-Yes/YAP axis[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20(4):837-846.

[10] Zhang L, Yang S, Chen X, et al. The hippo pathway effector YAP regulates motility, invasion, and castration-resistant growth of prostate cancer cells[J]. Mol Cell Biol, 2015, 35(8):1350-1362.

[11] Gao Y, Shi Q, Xu S, et al. Curcumin promotes KLF5 proteasome degradation through downregulating YAP/TAZ in bladder cancer cells[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(9):15173-15187.

[12] Strillacci A, Valerii MC, Sansone P, et al. Loss of miR-101 expression promotes Wnt/β-catenin signalling pathway activation and malignancy in colon cancer cells[J]. J Pathol, 2013, 229(3):379-389.

[13] Wang Y, Hu G, Liu F, et al. Deletion of Yes-associated protein (YAP) specifically in cardiac and vascular smooth muscle cells reveals a crucial role for YAP in mouse cardiovascular development[J]. Circ Res, 2014, 114(6):957-965.

[14] Liu T, Liu Y, Gao H, et al. Clinical significance of Yes-associated protein overexpression in cervical carcinoma: the differential effects based on histotypes[J]. Int J Gynecol Cancer, 2013, 23(4):735-742.

[15] 張寧南， 余閆宏， 肖民輝， 等. 膀胱癌中YAP基因的表達以及靶向干擾 YAP 對膀胱癌細胞株的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志, 2015, 25(13):40-42.

[16] Tang H, Kong Y, Guo J, et al. Diallyl disulfide suppresses proliferation and induces apoptosis in human gastric cancer through Wnt-1 signaling pathway by up-regulation of miR-200b and miR-22[J]. Cancer Lett, 2013, 340(1):72-81.

[17] Dudek H, Wong DH, Arvan R, et al. Knockdown of β-catenin with dicer-substrate siRNAs reduces liver tumor burdeninvivo[J]. Mol Ther, 2014, 22(1):92-101.

[18] Cojoc M, Peitzsch C, Kurth I, et al. Aldehyde dehydrogenase is regulated by β-catenin/TCF and promotes radioresistance in prostate cancer progenitor cells[J]. Can-cer Res, 2015, 75(7):1482-1494.

[19] Chen YC, Huang RL, Huang YK, et al. Methylomics analysis identifies epigenetically silenced genes and implies an activation of β-catenin signaling in cervical cancer[J]. Int J Cancer, 2014, 135(1):117-127.

[20] Pierzynski JA, Hildebrandt MA, Kamat AM, et al. Genetic variants in the Wnt/β-catenin signaling pathway as indicators of bladder cancer risk[J]. J Urol, 2015, 194(6):1771-1776.

[21] 萬雪蓮，馬菲菲，馬紅瑩，等. HepaCAM 通過 Wnt/β-catenin 信號通路抑制膀胱癌細胞 T24 的增殖[J]. 中國細胞生物學學報, 2015, 37(5):683-688.

[22] Moroishi T, Park HW, Qin B, et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway ho-meostasis[J]. Genes Dev, 2015, 29(12):1271-1284.

[23] Ye Q, Yao G, Zhang M, et al. A novel ent-kaurane diterpenoid executes antitumor function in colorectal cancer cells by inhibiting Wnt/β-catenin signaling[J]. Carcinogenesis, 2015, 36(3):318-326.

[24] Heallen T, Zhang M, Wang J, et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size[J]. Science, 2011, 332(6028):458-461.

[25] Imajo M, Miyatake K, Iimura A, et al. A molecular mechanism that links Hippo signaling to the inhibition of Wnt/β-catenin signaling[J]. EMBO J, 2012, 31(5):1109-1122.

[26] Cheung HW, Cowley GS, Weir BA, et al. Systematic investigation of genetic vulnerabilities across cancer cell lines reveals lineage-specific dependencies in ovarian cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A., 2011, 108(30):12372-12377.

[27] Konsavage WM Jr, Kyler SL, Rennoll SA, et al. Wnt/β-catenin signaling regulates Yes-associated protein (YAP) gene expression in colorectal carcinoma cells[J]. J Biol Chem, 2012, 287(15):11730-11739.