長鏈非編碼RNA PVT1調(diào)控miR-551通過Wnt信號(hào)通路對(duì)卵巢癌遷移和侵襲的影響*

聶金霞， 劉 婭， 徐明明

(鄭州市婦幼保健院婦產(chǎn)科， 河南 鄭州 450000)

卵巢癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，是全世界女性惡性腫瘤死亡的最主要原因[1]。雖然現(xiàn)在有多重治療方法，比如手術(shù)治療、化療、放療及生物靶向治療，可以改善大部分早期患者預(yù)后，但是晚期患者復(fù)發(fā)率仍很高[2]。所以卵巢癌早期診斷很重要，這是提升卵巢癌患者生存率的重要方式[3]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)PVT1(plasmacytoma variant translocation 1)位于人染色體8q24.21，與多種腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、淋巴侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[4]。PVT1在胃癌、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中異常表達(dá)[5-8]。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，PVT1在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，并且PVT1作為促癌基因可以增加卵巢癌的高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[9]。然而，PVT1的靶基因及其調(diào)節(jié)卵巢癌腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制仍然是未知的。

微小RNA(microRNA，miR)-551在很多組織中存在，一旦出現(xiàn)表異常或突變，容易誘發(fā)各種腫瘤的發(fā)生，包括胃癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等[10]。最近研究顯示，miR-551在多種人類組織中發(fā)揮了雙向的作用。它在肝細(xì)胞癌和宮頸癌中發(fā)揮癌基因的功能，但在胰腺癌和卵巢癌中起腫瘤抑制因子的作用[11]。

本研究通過探討PVT1和miR-551在卵巢癌中的相互作用，揭示它們致卵巢癌作用的潛在機(jī)制。我們的研究結(jié)果表明，PVT1通過誘導(dǎo)miR-551的表達(dá)激活Wnt信號(hào)通路，從而實(shí)現(xiàn)致卵巢癌作用。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞株

卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、ES-2、A2780及OVCA432購買于上海細(xì)胞研究所。細(xì)胞培養(yǎng)在含5%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)。

2材料和試劑

兔單克隆抗Wnt1、GSK-3和APC抗體購于Abcam；miR-551-inhibitor購于上海吉瑪基因有限公司；SsoFast EvaGreen試劑及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購于TaKaRa；Trizol購自Ambion；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)購自TOYOBO；PCR試劑盒購自Sigma；螢光素酶活性檢測(cè)試劑盒購自Promega；螢光素酶報(bào)告載體由Promega公司合成。

3方法

3.1qPCR檢測(cè)卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞中PVT1和miR-155的表達(dá)水平 提取卵巢癌組織和各卵巢癌細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)cDNA。PVT1的上游引物序列為5’-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3’，下游引物序列為5’-AGAGCACCAAGACTG GCTCT-3’；miR-551的上游引物序列為5’-TGGAGCGATGTGCGATGAGC-3’，下游引物序列為5’-AGAGCACCAAGACTGGCTCT；內(nèi)參照GAPDH的上游引物的序列為5’-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3’，下游引物序列為5’-TGTCATCATATTT GGCAGGTT-3’。擴(kuò)增條件為:95 ℃初始變性10 min； 95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s， 45個(gè)循環(huán)。使用LightCycler 480 Probes Master試劑盒(Roche Applied Science)在PCR儀器(Roche Applied Science)中進(jìn)行qPCR。采用2-ΔΔCt法分析相對(duì)表達(dá)量。

3.2雙螢光素酶活性檢測(cè) 將螢光素酶報(bào)告載體與miR-551-inhibitor共轉(zhuǎn)染ES-2細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染pRL-TK作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)質(zhì)控。轉(zhuǎn)染36 h后，收獲細(xì)胞。按螢光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)ES-2細(xì)胞中螢光素酶活性。相對(duì)螢光素酶活性=螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值。

3.3Western blot方法 從卵巢癌細(xì)胞ES-2中提取總蛋白。將總蛋白的等分試樣(40 mg)行10% SDS-PAGE，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。以1∶1 000、1∶1 000和1∶200的稀釋度分別使用抗Wnt1、GSK-3和APC抗體進(jìn)行孵育，4 ℃過夜，次日PBS洗滌后，加入 II 抗，室溫孵育PBS充分洗滌后進(jìn)行ECL顯影，拍照并統(tǒng)計(jì)相對(duì)表達(dá)量。

3.4細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定 使用Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行卵巢癌細(xì)胞侵襲能力測(cè)定。將5×104個(gè)細(xì)胞接種在含無血清培養(yǎng)基的上室中，下室裝有含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。 37 ℃孵育48 h后，棉球擦拭上室細(xì)胞，使用結(jié)晶紫染色下室細(xì)胞。觀察并計(jì)數(shù)穿透Transwell膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

比如，當(dāng)教師在講解課文《小蝌蚪找媽媽》時(shí)，首先，教師可以結(jié)合自己對(duì)文章的理解，制作出教學(xué)的大綱：小蝌蚪找媽媽的起因、小蝌蚪找媽媽的過程、找錯(cuò)媽媽的原因、最終的結(jié)果。其次，教師可以針對(duì)教學(xué)大綱制作教學(xué)視頻，幫助學(xué)生形成知識(shí)脈絡(luò)，降低學(xué)生的學(xué)習(xí)難度。在正式教學(xué)的過程中，教師可以要求學(xué)生按照視頻中所體現(xiàn)的知識(shí)結(jié)構(gòu)對(duì)課文進(jìn)行學(xué)習(xí)，加深對(duì)知識(shí)的理解，提升自身的學(xué)習(xí)質(zhì)量。

3.5細(xì)胞遷移能力的測(cè)定 將細(xì)胞密度調(diào)整為5×108/L，接種到6孔板中，置于 5% CO2溫箱孵育過夜，使細(xì)胞匯合度達(dá)到 100%。細(xì)胞劃痕先用記號(hào)筆在每個(gè)孔的背面做好標(biāo)記，以保證獲取數(shù)據(jù)的位置保持一致。用無菌槍頭，垂直于標(biāo)記線快速進(jìn)行劃痕。并用 PBS 緩沖液反復(fù)沖洗細(xì)胞孔，將懸浮細(xì)胞去除。向培養(yǎng)孔加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃孵育。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的時(shí)點(diǎn)取樣，在顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕的初始距離(0 h)；在24 h、48 h和72 h后，分別測(cè)量劃痕的距離，并拍照，計(jì)算細(xì)胞的遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 將2×107個(gè)卵巢癌細(xì)胞ES-2離心，用50 μL PBS稀釋重懸待用。取10只4周齡的裸鼠，分為陰性對(duì)照(negative control，NC)組和PVT1-siRNA組，每組5只。將轉(zhuǎn)染NC序列和PVT1-siRNA的卵巢癌細(xì)胞分別注射入2組裸鼠的左側(cè)腋下，6周后將腫瘤剝除，測(cè)量并稱重。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組之間數(shù)據(jù)比較采取獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1PVT1和miR-551在卵巢癌組織中的表達(dá)水平

與正常卵巢組織比較，PVT1 在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著升高(P<0.05), miR-551在卵巢癌組織中的表達(dá)降低(P<0.05)，表明PVT1和miR-551在卵巢癌中分別扮演促癌和抑癌的作用。在4種不同的卵巢癌細(xì)胞株中，ES-2細(xì)胞株中PVT1的表達(dá)水平明顯高于其它3種細(xì)胞，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取ES-2作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，見圖1。

Figure 1. The expression of PVT1 and miR-551 detected by qPCR in ovarian cancer tissue, normal ovarian tissue and different ovarian cancer cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal tissue；##P<0.01vsES-2.

圖1qPCR檢測(cè)PVT1和miR-551在卵巢癌組織中的表達(dá)情況

2PVT1可以調(diào)控卵巢癌細(xì)胞miR-551的表達(dá)水平

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PVT1和miR-551有可結(jié)合的位點(diǎn)，見圖2A。雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)表明，PVT1可以靶向調(diào)控miR-551的表達(dá)，見圖2B。我們推測(cè)，miR-551可能是PVT1下游的相應(yīng)靶點(diǎn)，PVT1可能通過調(diào)控miR-551的表達(dá)來影響卵巢癌的生物學(xué)行為。

Transwell結(jié)果顯示，NC組通過Matrigel的細(xì)胞數(shù)量明顯多于PVT1-siRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明抑制PVT1的表達(dá)可以下調(diào)卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力，見圖3A。與NC組相比，在24 h、48 h和72 h時(shí)，PVT1-siRNA組的遷移率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，表明抑制PVT1的表達(dá)可以下調(diào)卵巢癌細(xì)胞的遷移能力，見圖3B。

4miR-551可以逆轉(zhuǎn)PVT1對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響

抑制PVT1的表達(dá)后，再抑制miR-551的表達(dá)情況，觀察卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。Trans-well結(jié)果顯示，PVT1-siRNA組通過Matrigel的細(xì)胞數(shù)量明顯少于PVT1-siRNA+miR-551-inhibitor組(P<0.01)，表明抑制PVT1的表達(dá)后，通過抑制miR-551可以恢復(fù)卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力，見圖4A。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與PVT1-siRNA組相比，在24 h、48 h和72 h時(shí)，PVT1-siRNA+miR-551-inhibitor組遷移率明顯增高(P<0.05或P<0.01)，表明抑制PVT1的表達(dá)后，通過下調(diào)miR-551可以恢復(fù)卵巢癌細(xì)胞的遷移能力，見圖4B。

Figure 2. Relationship between PVT1 and miR-155. A: the binding sequences of PVT1 and miR-551; B: the results of dual-luciferase reporter assay indicated that miR-551 was a direct target of PVT1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖2螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-551是PVT1的直接靶點(diǎn)

Figure 3. The effects of PVT1-siRNA on the invasion and migation abilities of the ovarian cancer cells were detected by Transwell assay (A) and scratch test (B), respectively (×40). Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsNC group.

圖3Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PVT1-siRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

5PVT1對(duì)Wnt通路蛋白水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，PVT1-siRNA組中Wnt1、GSK-3和APC蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，表明PVT1的表達(dá)下調(diào)可以影響Wnt1、GSK-3和APC蛋白的表達(dá)水平，從而影響Wnt信號(hào)通路的激活，見圖5。

6抑制PVT1對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外成瘤能力的影響

與NC組相比，PVT1-siRNA組裸鼠腫瘤的重量和體積都明顯減小(P<0.05)，表明抑制PVT1的表達(dá)可以抑制卵巢癌細(xì)胞的體外成瘤能力，見圖6。

討 論

許多研究表明，PVT1基因組區(qū)域位于人染色體8q24，與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)[12]。PVT1基因的易位容易引起伯基特淋巴瘤和小鼠漿細(xì)胞瘤相關(guān)的特征性病變[13]。有其他學(xué)者關(guān)于PVT1與細(xì)胞存活能力的實(shí)驗(yàn)是探討PVT1干擾靶向性RNA的能力，沒有探討對(duì)其分子機(jī)制的影響過程。我們的研究表明，PVT1表達(dá)水平的降低可以導(dǎo)致細(xì)胞侵襲和遷移能力的減弱，證明了PVT1在卵巢癌中的促癌作用。并且根據(jù)其他學(xué)者的研究，PVT1的表達(dá)也間接影響p53基因水平，表明可能PVT1也可能參與p53基因的正反饋調(diào)節(jié)通路[14]。

LncRNA PVT1在各種癌癥中廣泛存在的有效預(yù)測(cè)因子，已被證明在多種生物腫瘤的進(jìn)展過程中起重要作用，如增殖、凋亡、遷移和侵襲[15]。在我們以前的研究中，我們確認(rèn)PVT1預(yù)測(cè)患者預(yù)后和調(diào)節(jié)卵巢癌的生長。 然而，潛在的分子機(jī)制和相關(guān)的靶向基因仍不清楚。 在這項(xiàng)研究中，我們實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明PVT1可以通過miR-551的負(fù)調(diào)節(jié)顯示致癌活性。PVT1通過介導(dǎo)miR-551表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展。

Figure 4. The effects of miR-551-inhibitor on the invasion and migration abilities of the ovarian cancer cell were detected by Transwell assay (A) and scratch test (B), respectively (×40). Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsPVT1-siRNA group.

圖4Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-551-inhibitor對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Figure 5. The effects of PVT1 on the expression of Wnt signaling pathway-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖5PVT1對(duì)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Theinvivotumorigenesis of the ovarian cancer cells transfected with PVT1-siRNA. A: the tumor size; B: the tumor weight; C: the tumor volume. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖6體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討PVT1-siRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響

以前的研究表明，PVT1在多種人類癌癥中過表達(dá)，并與細(xì)胞增殖、凋亡、淋巴結(jié)侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤預(yù)后相關(guān)[20]。最近的研究表明，PVT1的上調(diào)抑制了胃癌細(xì)胞系的凋亡，增加了MDR1、MRP、mTOR和HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)了多藥耐藥的發(fā)展。在本項(xiàng)研究中，我們調(diào)查卵巢癌中miR-551的生物學(xué)功能，證實(shí)了miR-551可以恢復(fù)PVT1對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。由于兩者之間負(fù)調(diào)節(jié)的關(guān)系，當(dāng)miR-551在卵巢癌細(xì)胞中被抑制時(shí)，PVT1-siRNA的抑癌作用被抵消。這些結(jié)果表明PVT1調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制與miR-551密切相關(guān)。它提供了在功能方面的PVT1和miR-551之間的相互抑制的證據(jù)。

總之，我們的研究表明lncRNA PVT1和miR-551在卵巢癌發(fā)生和發(fā)展中的互相調(diào)節(jié)關(guān)系。 更好地理解調(diào)控卵巢癌腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，有助于卵巢癌的早期診斷及治療方案的制定，為卵巢癌的臨床診斷和治療提供必要的幫助。

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