DDTs污染農(nóng)田土壤的強化微生物修復研究

王曉旭，孫麗娜，鄭學昊，吳 昊，王 輝，劉春躍

（沈陽大學區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復教育部重點實驗室，沈陽 110044）

滴滴涕[（1，1，1-trichloro-2，2-bis（p-chlorophenyl）ethane，DDT]是環(huán)境中典型的持久性有機污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs），由于其突出的持久性、生物蓄積性，并對生物體存在潛在毒性而受到廣泛關注[1]，許多國家都將其列入優(yōu)先控制污染物的黑名單中。環(huán)境中殘留的DDT同分異構體/初級代謝產(chǎn)物主要包括 p，p′-DDT、o，p′-DDT、p，p′-DDE 和 p，p′-DDD，統(tǒng)稱DDTs。由于DDTs的親脂性，易被土壤顆粒吸附，使土壤成為其主要的環(huán)境歸宿之一[2]。雖然我國早在1983年已經(jīng)禁止使用DDTs，但各地土壤中仍能檢測到不同濃度的DDTs殘留[3]。殘留在土壤中的DDTs可以通過遷移、轉化及食物鏈等進入其他環(huán)境介質和生物體，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成潛在危害[4]。因此，對DDTs污染土壤進行修復是極其必要的。

微生物降解是DDTs污染土壤修復經(jīng)濟有效的方法[5]。但對于疏水性強的DDTs化合物，較低的生物利用性是限制其微生物修復效率的主要因素[6]。此外，在現(xiàn)場修復環(huán)境中，通常采用定期接種新的降解菌以及添加微生物生長所需營養(yǎng)物以提高污染土壤中降解菌的數(shù)目和活性[7-8]。因此，采用強化手段提高微生物修復效率成為生物修復DDTs污染土壤的關鍵。血粉是良好的動物性蛋白飼料，是屠宰禽畜時所得血液經(jīng)干燥制成的。血粉中不僅含有豐富的氨基酸和多種微量元素，而且粗蛋白含量可達到80%～90%，可以對微生物的生長繁殖起促進作用。血粉作為一種微生物刺激物，近期在我國已成功應用于原位處理DDTs污染土壤的生物修復中，并取得了良好的修復效果[9]。因此，血粉可以作為微生物刺激物應用于污染農(nóng)田土壤修復中。另外，針對DDTs極易被土壤固相吸附，導致其生物利用性低的問題，人們通常利用表面活性劑的增溶作用提高疏水性有機污染物（Hydrophobic Organic Compounds，HOCs）的溶解性和生物可利用性，從而達到促進微生物降解、提高修復效率的目的[10-11]。目前，該技術中多采用單一表面活性劑進行強化修復，而陰-非離子混合表面活性劑可協(xié)同增溶土壤中有機污染物，有效降低表面活性劑用量，且環(huán)境適應范圍更廣泛[12]。因此，在污染土壤的生物強化修復研究中受到廣泛關注。如陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉SDBS和非離子表面活性劑Tween 80已被報道用于PAHs污染土壤的微生物修復研究中[13-14]，但田間應用表面活性劑強化微生物降解DDTs方面的研究較少。

因此，本研究針對國內DDTs等有機污染土壤修復技術需求，在前期的研究基礎上，以東北地區(qū)設施農(nóng)業(yè)DDTs污染土壤為對象，開展現(xiàn)場微生物原位修復及血粉、陰-非離子混合表面活性劑強化修復措施，同時探討了修復過程中對DDT同分異構體/初級代謝產(chǎn)物的影響，以期為DDTs等有機污染土壤的微生物強化修復技術提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 修復場地

實驗場地位于沈陽市沈北新區(qū)某設施農(nóng)業(yè)大棚內，平整實驗田0~20 cm表層土壤，去除植物根系、石礫、塑料等殘留物，不斷進行翻耕混勻。土壤基本理化性質參照土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法測定[15]：土壤容重1220 kg·m-3，pH 值 6.39，有機質 62.18 g·kg-1，總氮3.09 g·kg-1，總磷 0.69 g·kg-1，粘粒、粉粒和砂粒含量分別為24.78%、74.07%、1.15%，土壤類型為粉砂質粘土。實驗田 DDTs平均濃度為 130.63 μg·kg-1，其中 p，p′-DDT、o，p′-DDT、p，p′-DDD 和 p，p′-DDE 分別為95.56、6.08、8.95 μg·kg-1和 20.04 μg·kg-1。

1.2 主要實驗材料

混合菌：球形節(jié)桿菌（Arthrobacter globiformis）和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）由本課題組分離、培養(yǎng)[16]。球形節(jié)桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌按2∶1（體積比）混合配成混合菌液。

血粉：購于貴州金萬和農(nóng)業(yè)科技有限公司。

陰-非離子混合表面活性劑：即十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）和失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚（Tween 80），購于國藥集團化學試劑有限公司，其混合質量比為 2∶3。

DDTs標準樣品：p，p′-DDE、p，p′-DDD、o，p′-DDT、p，p′-DDT（濃度 100 μg·mL-1）購于百靈威科技有限公司，采用氣相色譜儀（CP-3800，美國Varian）進行DDTs分析。

1.3 實驗設計

各田間實驗小區(qū)面積均為1.0 m×1.0 m，相鄰小區(qū)間設置約20 cm隔離溝。共設置兩組實驗：

實驗一，混合菌的接種方式對DDTs污染土壤的影響：（1）初始 1 次接種混合菌（PN-1）；（2）連續(xù) 3 次接種混合菌（3PN-1），按照每30 d接種1次的頻率進行添加。在每次噴施降解菌過程中進行翻耕混勻。同時設不接種的小區(qū)作為對照（CK）。

實驗二，在實驗一的基礎上，研究不同強化措施對混合菌修復DDTs污染土壤的影響：（1）添加血粉和接種混合菌（3X+3PN-1）；（2）添加陰-非離子混合表面活性劑SDBS-Tween 80和接種混合菌（3H+3PN-1）；（3）添加陰-非離子混合表面活性劑SDBSTween 80、血粉和接種混合菌（3X+3H+3PN-1）。上述3種處理均在每30 d添加1次，并進行翻耕混勻。

對照與處理小區(qū)各設置3個平行重復。修復周期為 90 d，為空白樣地，分別在 0、30、60、90 d 時使用梅花取樣法對每個小區(qū)采集表層0~20 cm處土壤樣品并混合均勻，監(jiān)測土壤中DDTs的殘留量。其中初始1次接種混合菌的菌液量為1.5 L·m-2，每30 d接種1次混合菌的菌液量為500 mL·m-2，菌落形成單位均為1×108mL-1；血粉每次添加量為 5 g·kg-1土；SDBSTween 80每次添加量為100 mg·kg-1土；混勻翻耕深度為0~20 cm表層土壤，定期澆水，使土壤含水率保持在最大田間持水量的60%。

1.4 土壤樣品中DDTs的前處理方法和殘留測定條件

土壤樣品室溫自然風干后，碾磨粉碎過60目篩，稱取5.0 g試樣，移入萃取池中，加硅藻土把萃取池填滿，土壤中DDTs的提取采用加速溶劑萃取法，萃取液為正己烷和丙酮混合液（體積比1∶1）[17]。萃取后的溶液使用濃硫酸磺化法對萃取液進行凈化[18]，凈化后使用氮吹法使樣品近干后，用色譜純正己烷定容到1.0 mL，然后過0.45 μm有機濾膜，轉移到氣相進樣瓶中，使用氣相色譜-電子捕獲檢測器（GC-ECD）進行測定。

測定條件：色譜柱為CP-sil 8CB型石英毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；色譜柱升溫程序為初始溫度120℃并保持1 min，以25℃·min-1升至230℃，再以3℃·min-1升至255℃，最后以20℃·min-1升至280℃保持5 min；進樣口溫度250℃；檢測器溫度300℃。載氣、輔助氣均為高純氮氣，載氣流速為0.6 mL·min-1（恒流）。進樣方式為脈沖不分流進樣，脈沖壓力276kPa、保持 0.75min，進樣量 1μL；尾吹 30mL·min-1。以色譜峰保留時間定性，外標法定量，方法的線性范圍為 2~200 μg·L-1，檢出限為 0.87~2.63 μg·kg-1，加標回收率為89.2%~107.1%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0和SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行處理分析作圖。

2 結果與討論

2.1 混合菌的接種方式對DDTs污染農(nóng)田土壤的影響

降解菌在土壤中的定殖是決定DDTs污染土壤微生物修復的關鍵，投加到實際污染土壤中的降解菌往往會存在菌體流失的現(xiàn)象[19]，因此本研究通過90 d的田間實驗，比較對照組（CK）、初始1次接種混合菌（PN-1）和分3次接種混合菌（3PN-1）對農(nóng)田土壤中DDTs殘留濃度動態(tài)變化的情況，結果如圖1所示。與各田間小區(qū) DDTs本底值（129.58~131.10 μg·kg-1）相比，不添加任何修復措施的CK在90 d殘留量變化不明顯，降解率僅為4.6%。說明土壤中雖然存在降解DDTs的土著微生物，但這種降解作用非常緩慢。

圖1 混合菌的接種方式對DDTs污染農(nóng)田土壤的影響Figure 1 Effects of inoculating mixed bacteria on the biodegradation of DDTs contaminated farmland soil

在接種混合菌的兩種處理中，土壤中DDTs殘留量在前30 d內降低迅速，3PN-1處理的DDTs殘留濃度與PN-1處理相比雖有減少，但并不顯著。其原因可能是當接菌量達到一定濃度時，菌體與底物已經(jīng)充分接觸，此時接菌量已經(jīng)接近飽和，不再是制約降解DDTs的主要原因[20]。而在隨后的30~90 d，3PN-1和PN-1兩種處理的DDTs殘留濃度變化出現(xiàn)差異。PN-1處理在30~90 d DDTs殘留濃度降低幅度較小，90 d后DDTs降解率為41.9%，僅比第30 d提高了5.5%，這表明初始1次性接種混合菌，隨著培養(yǎng)時間的延長，降解菌會逐漸衰亡，導致降解效果變差。而3PN-1處理在30~90 d DDTs殘留濃度亦有不同程度下降，90 d后DDTs降解率達到50.5%，比第30 d提高了17.1%。雖然3PN-1處理每30 d均有接種1次混合菌菌液，但是30 d之后殘留濃度的下降程度逐漸減弱，其原因可能是：一方面，土壤中DDTs濃度降低，導致反應速度減慢；另一方面，DDTs降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物的競爭代謝和毒性作用[21]，也可能造成微生物降解速率降低。與本研究類似，謝慧[22]通過盆栽試驗研究了降解菌株DXZ9對模擬DDTs污染土壤的影響，結果表明土壤中DDTs殘留濃度在前期降低較快，后期降低較慢，DDTs降解率最高達到65.5%，高于本研究中混合菌對DDTs降解率，這可能是由于田間土壤環(huán)境較為復雜，殘留在土壤中的DDTs經(jīng)過長期老化其生物可利用性大幅降低。綜上所述，分3次接種混合菌比初始1次接種混合菌對DDTs修復效果好（P＜0.05）。這與Boon等[23]報道生物強化中投加土著降解菌即使是從原污染環(huán)境中分離篩選出的并有適宜的生長環(huán)境也難以長期存活，必須要定期補充接種新的降解菌是一致的。因此，為保證降解菌在土壤中的存活和繁殖，需定期連續(xù)地接種混合菌。

2.2 不同強化措施對混合菌修復DDTs污染農(nóng)田土壤的影響

采用定期添加血粉（3X）和陰-非離子混合表面活性劑 SDBS-Tween 80（3H）強化混合菌（3PN-1）修復DDTs農(nóng)田土壤的影響如圖2所示。經(jīng)過90 d的修復，與單獨接種混合菌3PN-1處理相比，采用不同強化措施均可顯著降低土壤中DDTs的殘留（P＜0.05），3X+3PN-1、3H+3PN-1、3X+3H+3PN-1 修復后土壤中DDTs殘留濃度分別為 56.08、47.66、44.56 μg·kg-1，平均降解率分別達到57.5%、63.2%和65.9%。添加營養(yǎng)物質可以提高微生物降解活性，而且相關研究表明外加碳源不僅有利于微生物定殖，還能作為共代謝底物促進DDTs的降解[24]。血粉中營養(yǎng)物比較豐富，可以為微生物提供足夠碳源，刺激微生物提高其活性。王輝等[9]研究了添加營養(yǎng)物對土著微生物修復DDTs污染土壤的影響，結果表明，與葡萄糖相比較，血粉能夠更長效地刺激土著微生物提高其活性，更有效地提高土壤中DDTs的微生物降解率。因此，添加血粉強化混合菌（3X+3PN-1）可以使土壤中DDTs殘留濃度顯著降低。與3X+3PN-1處理相比，3H+3PN-1處理可以使土壤中DDTs殘留濃度進一步降低。已有研究表明，陰-非離子混合表面活性劑可產(chǎn)生協(xié)同增溶作用，減少各自的吸附或沉淀損失，增加了土壤中的有效濃度，促進了DDTs從土壤顆粒中解吸下來，進而提高了DDTs的生物可利用性和微生物降解效率[25]。陳蘇等[26]報道SDBS-Tween 80濃度僅為70 mg·kg-1土時，即可達到對微生物修復DDTs污染土壤較好的效果，150 d后DDTs降解率達到64.0%。因此，較低濃度的SDBS-Tween 80能有效促進土壤中DDTs的生物修復效果，同時降低了田間應用表面活性劑的成本。3X+3H+3PN-1聯(lián)合作用對DDTs降解的促進作用強于單獨的3X+3PN-1和3H+3PN-1處理，這說明血粉和SDBS-Tween 80在促進DDTs降解方面存在協(xié)同作用。外加血粉提高微生物降解活性；添加SDBSTween 80提高了DDTs生物可利用性，兩者共同促進了土壤中DDTs降解。

圖2 不同強化措施對混合菌修復DDTs污染農(nóng)田土壤的影響Figure 2 Effects of different enhanced measures on mixed bacteria remediation of DDTs contaminated farmland soils

為比較不同強化措施間DDTs的修復效果是否具有顯著差異，對3X+3PN-1、3H+3PN-1和3X+3H+3PN-1修復后DDTs殘留濃度進行兩兩之間t檢驗。在成對t檢驗中，3X+3PN-1與3H+3PN-1之間具有顯著性差異（P＜0.05），且3H+3PN-1處理后土壤中DDTs殘留濃度較低。表明與添加血粉相比，利用SDBS-Tween 80強化混合菌對土壤中DDTs修復效果更顯著；3H+3PN-1與3X+3H+3PN-1之間無顯著差異（P＞0.05），即添加血粉并沒有顯著提高SDBSTween 80與混合菌對土壤中DDTs的修復效果。因此，考慮到田間修復成本，利用SDBS-Tween 80強化混合菌處理即可達到對DDTs污染土壤較好的修復效果。

2.3 不同強化措施下農(nóng)田土壤中DDT同分異構體/初級代謝產(chǎn)物的殘留情況

混合菌的接種方式、添加血粉和陰-非離子混合表面活性劑SDBS-Tween 80強化修復后，土壤中DDT 同分異構體/初級代謝產(chǎn)物（p，p′-DDT、o，p′-DDT、p，p′-DDD 和 p，p′-DDE）殘留情況見圖 3。圖 3a為不同強化措施下土壤中 p，p′-DDT 殘留濃度。p，p′-DDT是DDTs中有效的殺蟲活性成分，生物毒性強，在土壤環(huán)境中消失緩慢，半衰期可達到30年[27]。采用不同強化措施修復90 d后，可以看出土壤中p，p′-DDT殘留濃度顯著降低。其中，PN-1處理在修復30 d后，p，p′-DDT降解速度明顯比其他處理低，這表明僅初始接種1次混合菌，其降解活性會隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低，導致p，p′-DDT降解效果變緩。而每 30 d接種 1次混合菌的處理（3PN-1），p，p′-DDT殘留量亦呈現(xiàn)不斷降低趨勢?？梢钥闯雠c3PN-1處理對比，3H+3PN-1和3X+3H+3PN-1兩種處理對p，p′-DDT修復效果更好。從圖3b中可見，修復90 d后不同強化措施間o，p′-DDT殘留濃度相差不大，其原因可能是土壤中殘留的o，p′-DDT濃度較低，不利于微生物降解，但o，p′-DDT殺蟲活性較弱，對生態(tài)環(huán)境影響相對較小。圖3c為不同強化措施下土壤中p，p′-DDD殘留濃度。與土壤中其他DDT同分異構體/初級代謝產(chǎn)物相比，p，p′-DDD殘留濃度下降較為緩慢，其原因為p，p′-DDD在厭氧條件下可以被降解細菌進一步還原脫氯至DDMS和DDNU[28]，而表層土壤以有氧條件為主，對p，p′-DDD進一步降解不利，其中以3H+3PN-1處理對p，p′-DDD殘留濃度下降最為明顯。由圖3d可以看出，PN-1、3PN-1和3X+3PN-1處理p，p′-DDE殘留濃度在降解30 d后出現(xiàn)累積現(xiàn)象，這可能是由于各異構體間相互轉化所導致的。p，p′-DDE 是 p，p′-DDT 在有氧條件下生物降解主要的代謝產(chǎn)物之一[29]，當在某個時期，還來不及再轉化消失，p，p′-DDE會暫時累積，出現(xiàn)殘留濃度升高的現(xiàn)象。這與Fan等[30]研究白腐真菌在人工模擬DDTs污染土壤條件下對p，p′-DDE降解情況類似。p，p′-DDE比其母體化合物具有更強的持久性、生物蓄積性和生態(tài)毒性[31]，因此去除土壤中殘留的p，p′-DDE非常重要。對比不同強化措施下土壤中p，p′-DDE殘留濃度可以看出，3H+3PN-1處理殘留濃度最低，對p，p′-DDE降解率高達62.4%。因此，綜合考慮不同強化措施對土壤中DDTs殘留濃度的影響及DDT同分異構體/初級代謝產(chǎn)物的修復效果，最終確定3H+3PN-1處理為適宜的強化措施，即利用陰-非離子混合表面活性劑SDBS-Tween 80強化混合菌修復DDTs污染土壤，修復90 d后DDTs降解率可達63.2%。

3 結論

（1）混合菌的接種方式對DDTs污染土壤修復存在顯著影響，連續(xù)3次接種的修復效果比1次好，DDTs的降解率最高可達50.5%，比對照組提高了45.9%，比1次接種混合菌提高了8.6%。

圖3 不同強化措施下土壤中DDT同分異構體/初級代謝產(chǎn)物的殘留情況Figure 3 Effects of DDT isomers/primary metabolites residue in different enhanced measures

（2）定期添加血粉和陰-非離子混合表面活性劑SDBS-Tween 80能明顯強化混合菌對土壤中DDTs的降解效果，3X+3PN-1、3H+3PN-1和3X+3H+3PN-1處理對土壤中DDTs降解率分別達到57.5%、63.2%和65.9%，比單獨接種混合菌處理分別提高了7.1%、12.8%和15.5%。

（3）SDBS-Tween 80強化混合菌處理（3H+3PN-1）可以顯著降低土壤中DDTs的殘留濃度，且對生態(tài)毒性強的p，p′-DDE去除效果好，有效降低了修復后的生態(tài)風險，為適宜的強化措施。

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