c-kit突變型與野生型胃腸道間質(zhì)瘤中基因表達(dá)譜的鑒定

陳 杰，王春萌，羅 鵬，楊凌舸，師英強(qiáng)

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院骨與軟組織外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是消化道最常見的間葉來(lái)源腫瘤，主要發(fā)生于胃和小腸，少數(shù)發(fā)生于腹膜后、網(wǎng)膜和腸系膜，約占全部胃腸道惡性腫瘤的2%［1］。近年來(lái)，GIST的概念提出后，其診斷和治療有了飛速發(fā)展，這得益于GIST中特征性遺傳改變被發(fā)現(xiàn)c-kit基因突變［1］。目前伊馬替尼是轉(zhuǎn)移性或不可切除GIST標(biāo)準(zhǔn)的一線治療藥物［7］。但是，越來(lái)越多的研究表明，伊馬替尼在治療GIST過(guò)程中存在原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥，且耐藥機(jī)制復(fù)雜，其中原因可能與腫瘤中存在繼發(fā)c-kit基因突變的多細(xì)胞克隆有關(guān)。因此，對(duì)于伊馬替尼原發(fā)或繼發(fā)耐藥的晚期GIST患者的治療目前仍是一個(gè)難題。在這一背景下，尋找新的致病因子及治療靶點(diǎn)，從而為胃腸道間質(zhì)瘤的治療提供新的策略和思路顯得十分重要。

c-kit基因位于人染色體4q12-13上，編碼Ⅲ型跨膜生長(zhǎng)因子受體。其受體蛋白由細(xì)胞內(nèi)酪氨酸蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及細(xì)胞外配體結(jié)構(gòu)域共同組成。已有研究指出，c-kit在多種腫瘤中表達(dá)異常，其在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)上調(diào)，但在乳腺癌、黑色素瘤及甲狀腺癌中呈低表達(dá)［2］。在肝癌中，TGF-β/c-kit能夠形成一個(gè)正反饋環(huán)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。但是，對(duì)于c-kit在腫瘤中的作用，我們?nèi)匀恢跎?。?guó)內(nèi)外研究表明，c-kit基因突變率為75%～80%［3］。其中最常見的是外顯子11突變(65%～70%)，以及外顯子9突變(10.0%)、外顯子13(1.7%)和外顯子17(1.3%)等少見突變位點(diǎn)。突變類型以缺失突變、點(diǎn)突變、混合突變和插入突變?yōu)橹鳎?］。靶向藥物甲磺酸伊馬替尼治療GIST的機(jī)制在于, 當(dāng)c-kit激酶激活后，使酪氨酸殘基磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡［5］。

除了由基因突變引起的GIST外，還有一類特殊GIST，即野生型GIST。實(shí)際這個(gè)命名并非完全準(zhǔn)確，而是對(duì)形態(tài)學(xué)符合GIST，CD117陽(yáng)性或陰性表達(dá)，同時(shí)未能檢測(cè)到c-kit和血小板源性生長(zhǎng)因子受體α(platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)基因突變的GIST的統(tǒng)稱。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，85%的兒童GIST和10%～15%的成人GIST既沒有c-kit基因突變，也沒有PDGFRA基因突變，故被稱為野生型［6］。到目前為止，野生型GIST的發(fā)病機(jī)制仍不明確，它并非是單一的GIST種類，而是一個(gè)由生物特性迥異的多個(gè)亞群組成的家族，其基因分子發(fā)病機(jī)制也可能不完全相同，這一領(lǐng)域亟需進(jìn)一步深入研究。

在本研究中，我們采用4對(duì)原發(fā)性GIST與相應(yīng)的癌旁組織，去除核糖體RNA后，構(gòu)建RNA測(cè)序文庫(kù)，采用美國(guó)Illumina公司Hiseq 2500進(jìn)行雙端測(cè)序。結(jié)合生物信息分析，用TopHat2得到c-kit突變型與野生型GIST中差異表達(dá)的基因。希望通過(guò)探索c-kit突變對(duì)于GIST組織表達(dá)譜的影響，從而為研究GIST的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，同時(shí)也嘗試為GIST的治療提供新的策略和思路。

1 材料和方法

1.1 組織樣本

4對(duì)GIST及其癌旁組織均來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃外科和骨與軟組織外科手術(shù)切除標(biāo)本，獲取標(biāo)本均得到倫理委員會(huì)的同意，并經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格病理診斷。

1.2 組織總RNA的抽提

采用TRIzol試劑(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)進(jìn)行組織總RNA的抽提。每毫升TRIzol中加入200 μL的氯仿萃取，將無(wú)色上清液轉(zhuǎn)移帶一個(gè)新的離心管中，加入等體積的異丙醇沉淀并以8 000×g的速率離心10 min，并用75%乙醇洗滌。棄上清液，室溫干燥RNA沉淀，用DEPC處理過(guò)H2O溶解沉淀，定量備用。

1.3 RNA測(cè)序

取3 μg總RNA，使用RiboMinus Eukaryote Kit(購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司)去除核糖體RNA，隨后用NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina(購(gòu)自美國(guó)NEB公司)構(gòu)建RNA測(cè)序文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)檢后，在Illumina NEX seq 500機(jī)器上進(jìn)行測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

差異表達(dá)基因熱圖、火山圖、GO富集分析及KEGG信號(hào)通路分析均使用R(3.3.2)軟件進(jìn)行分析，分別使用gplots、ggplot2和clusterProfiler pachage完成。

2 結(jié) 果

2.1 RNA測(cè)序預(yù)測(cè)受c-kit調(diào)控的基因

我們利用RNA高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)c-kit突變型與野生型的胃腸道間質(zhì)瘤組織進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序。首先，從4例c-kit野生型患者和4例c-kit突變型患者組織中抽提總RNA，并去除了其中的核糖體RNA。每個(gè)樣本都在Illumina HiSeq 2000測(cè)序儀上進(jìn)行RNA測(cè)序，并產(chǎn)生了約60兆的讀段。利用TopHat2軟件，我們將這些讀段映射到人類參考基因組中(GRCh37/hg19)。

此外，本研究分析了其中的mRNA，分析了c-kit突變型與野生型患者中表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)其中有263個(gè)基因差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。c-kit突變型與野生型中表達(dá)譜的差異提示，這263個(gè)基因可能受到c-kit基因的調(diào)控。

2.2 基因富集分析

為了探討c-kit突變對(duì)于GIST的影響，本研究對(duì)上述263個(gè)基因進(jìn)行了GO和KEGG通路富集分析。GO分析中將差異表達(dá)的基因按功能分為3大類：生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞成分(cellular component，CC)。GO分析結(jié)果顯示，這263個(gè)基因顯著富集于組蛋白分解過(guò)程、蛋白激酶激活劑及T細(xì)胞受體信號(hào)小體中(圖2，表1)。c-kit突變型與野生型GIST組織中，差異基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中富集于Hedgehog信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、過(guò)氧化物酶體、膽汁酸合成以及谷氨酰胺和谷氨酸的代謝通路中(圖2，表2)。

圖 1 c-kit 突變型與野生型的胃癌組織中差異表達(dá)基因Fig. 1 Differentially expressed genes of c-kit mutant and wild type GIST tissues

圖 2 GO和KEGG通路分析Fig. 2 GO and KEGG pathway analysis

表 1 表達(dá)差異的基因功能Tab. 1 The functions of the expression-differentiated genes

表 2 KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析Tab. 2 The enrichment analysis of KEGG pathway database

3 討 論

GIST能夠發(fā)生在消化系統(tǒng)中的許多位置，是最常見的胃腸道間葉源性腫瘤，常發(fā)生于腸系膜、胃等組織中，少量發(fā)生于十二指腸和直腸中。受體酪氨酸激酶c-kit和PDGFRA的突變被認(rèn)為是GIST的主要發(fā)病因素和推動(dòng)因素［1,4］。在GIST中c-kit具有高頻突變，其中常見的是第11號(hào)外顯子、第9號(hào)外顯子和第17號(hào)外顯子［5］。c-kit編碼的蛋白產(chǎn)物CD117的發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)更加敏感和特異的診斷指標(biāo)［6］?；蛲蛔冾愋湍軌驔Q定靶向藥物治療的敏感性。因此，一般推薦對(duì)患者術(shù)后的GIST標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)基因檢測(cè)。c-kit和PDGFRA的突變信息能夠顯著提升我們對(duì)于患者預(yù)后信息的判斷。在c-kit發(fā)生高頻突變患者中更容易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，也具有更差的無(wú)瘤生存［7］。同時(shí)，c-kit能夠作用GIST的治療靶點(diǎn)。隨著GIST靶向治療的廣泛開展，c-kit基因突變與靶向治療的關(guān)系已基本達(dá)成共識(shí)。研究最為集中的是GIST患者基因突變類型與目前最常用的一線靶向治療藥物伊馬替尼。伊馬替尼可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)，抑制c-kit和PDGFRA的自身磷酸化，進(jìn)而抑制c-kit和PDGFRA下游信號(hào)分子的異常激活。所以，通過(guò)了解c-kit在GIST分子層面上的影響，對(duì)進(jìn)一步闡明GIST發(fā)生和GIST靶向治療機(jī)制具有至關(guān)重要的作用［8］。

本研究對(duì)4例有c-kit突變和4例沒有c-kit突變的GIST組織進(jìn)行測(cè)序，尋找其背后的差異基因。發(fā)現(xiàn)有263個(gè)基因在這兩組患者腫瘤組織中有顯著性差異。其中，170個(gè)基因在野生型患者組織中的表達(dá)量高于c-kit突變型患者組織；而93個(gè)基因由于c-kit突變而得到上調(diào)。利用這些基因分析c-kit突變引起的細(xì)胞信號(hào)通路與功能變化，進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的基因廣泛參與組蛋白mRNA代謝、組蛋白去甲基化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及JNK信號(hào)通路等。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，c-kit引起的差異表達(dá)基因富集在Hedgehog、FoxO信號(hào)通路及谷氨酰胺、谷氨酸代謝通路中。許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展伴隨著如Hedgehog或FoxO信號(hào)通路的變化；反之，這些信號(hào)通路的變化也能調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［9-10］。本研究提示，c-kit在GIST發(fā)生中具有一定的作用，但仍有許多問(wèn)題亟待解決。在GIST中，c-kit的具體作用機(jī)制仍然需要更多的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物模型進(jìn)行詳細(xì)驗(yàn)證。

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