三七皂苷預(yù)防異丙腎上腺素所誘導(dǎo)小鼠陣發(fā)性房顫發(fā)生的機(jī)制研究

， ，2， ，2

房顫(atrail fibrillation，AF)即室上性快速性心律失常，由心房發(fā)出的不規(guī)律心房激動(dòng)。由于其無效性的心房收縮代替了有節(jié)律的心房收縮，機(jī)體可表現(xiàn)為疲勞、心悸、暈厥乃至心力衰竭等，嚴(yán)重影響著人類生活質(zhì)量及生命健康。隨著年齡的增加，AF發(fā)生率逐漸增加，美國(guó)心臟學(xué)會(huì)(America Heart Association，AHA)指出，60歲以下的成人AF發(fā)生率小于1%，而75歲到84歲老年人中，AF的發(fā)生率高達(dá)12%。且在歐洲人群中，40歲以上男性和女性發(fā)生AF的危險(xiǎn)性分別為26%和23%。我國(guó)流行病學(xué)指出，40歲以下成人中AF發(fā)生率為0.1%，而80歲以上男性和女性每年AF年的發(fā)生率分別為2%和1.5%[1- 4]。目前，AF的藥物治療中主要為抗凝藥物的選用，而針對(duì)于AF本身的藥物研究依舊是該研究領(lǐng)域中的一大空缺，因此新藥的開發(fā)尤其是中醫(yī)藥的研究應(yīng)用成為預(yù)防AF發(fā)生新的切入點(diǎn)。本課題組前期研究結(jié)果提示，PNS可有效預(yù)防大劑量異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)所誘導(dǎo)的陣發(fā)性房顫的發(fā)生，并顯著降低期前收縮發(fā)生率[5]。本研究探索PNS預(yù)防大劑量ISO所誘導(dǎo)的陣發(fā)性房顫發(fā)生的作用機(jī)制。

微小核苷酸(microRNAs，miRNAs)是由19～25個(gè)堿基所構(gòu)成的非編碼RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。據(jù)預(yù)測(cè)，miRNAs通過與靶基因3’UTRs結(jié)合控制著30%～50%基因的蛋白質(zhì)編碼，參與心臟發(fā)育、心肌重塑、心肌細(xì)胞凋亡等病理生理過程，在諸多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中引著重要的作用[6- 7]。因此，本研究圍繞miRNAs差異表達(dá)進(jìn)一步探索PNS抗ISO所誘導(dǎo)陣發(fā)性房顫發(fā)生的作用機(jī)制，以期為PNS的臨床應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6，雄性小鼠，體重20.58 g±0.65 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 試劑與儀器 三七皂苷購自泛亞生命科技有限公司；異丙腎上腺素購自上海源葉生物科技有限公司。Annexin V熒光染料購自BD公司(美國(guó))；總RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司(德國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自QIAGEN公司(德國(guó))。植入式無線遙測(cè)系統(tǒng)購自美國(guó)Date Sciences International (DSI) 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀購自Roche Diagnostics公司(瑞士)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將54只C57BL/6雄性小鼠，隨機(jī)分為正常組(n=18)、模型組(n=18)、治療組(n=18)。模型組以大劑量ISO (100 mg/kg) 100 μL腹腔注射誘導(dǎo)小鼠陣發(fā)性房顫的發(fā)生，治療組于造模前0.5 h腹腔注射PNS (150 mg/kg) 100 μL；模型則給予等體積的生理鹽水。正常組均給予等體積的生理鹽水。

1.3.2 心電圖監(jiān)測(cè) 各組隨機(jī)選取6只C57BL/6雄性小鼠，10%水合氯醛麻醉后，按照說明(Johansson&Thoren 1997)分別于腹部皮下植入ETA- F20植入子(Date Science International，St Paul，MN，USA)。前期實(shí)驗(yàn)操作分別檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房顫的發(fā)生率[5]。

1.3.3 病理形態(tài)學(xué)檢測(cè) 余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于注射ISO 1.5 h后，取其心臟組織，每組各取6只，4%多聚甲醛固定，4 μm 石蠟切片，分別進(jìn)行HE染色。并通過Annexin V 熒光探針法進(jìn)一步評(píng)價(jià)其細(xì)胞凋亡情況。

1.3.4 心臟組織中相關(guān)miRNAs的檢測(cè) 余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分離其心房組織，嚴(yán)格按照總RNA提取試劑盒(德國(guó)，QIAGEN公司)提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)，QIAGEN公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBG方法進(jìn)行RT- PCR試驗(yàn)分別檢測(cè)心房組織中miR- 29b，miR- 210，miR- 499，miR- 328的表達(dá)，以5s核糖體RNA作為內(nèi)參照(引物序列見表1)。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 PNS顯著預(yù)防大劑量ISO所誘導(dǎo)小鼠陣發(fā)性房顫的發(fā)生 正常組即PNS (- )； ISO (- )為典型正常心電圖表現(xiàn)，模型組即PNS (- )； ISO (+)出現(xiàn)典型的陣發(fā)性房顫發(fā)生的心電圖表現(xiàn)，而治療組即PNS (+)； ISO (+)未見房顫的發(fā)生。詳見圖1。

圖1 PNS顯著預(yù)防大劑量ISO誘導(dǎo)陣發(fā)性房顫的發(fā)生

2.2 PNS顯著改善大劑量ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡情況 模型組HE染色結(jié)果呈現(xiàn)，胞核染色明顯，胞核中可見多個(gè)核仁，可見核分裂相。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析各個(gè)心臟石蠟切片全視野中處于核分裂相的細(xì)胞核百分比。與正常組相比，模型組心臟石蠟切片中，核分裂相顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，治療組核分裂相百分比顯著降低(P<0.05)。詳見圖2。

進(jìn)一步明確細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)采用Annexin V 熒光染料法以檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。模型組心臟組織中可見大量綠色熒光。量化分析結(jié)果提示，與模型組相比，治療組心臟組織中綠色熒光顯著減少(P<0.05)。詳見圖3。

注：與模型組相比，* P<0.05。

圖2 PNS顯著減少心臟組織中核分裂相情況(標(biāo)尺：50 μm)

注：與模型組相比，* P<0.05。

圖3 PNS顯著減少心肌細(xì)胞凋亡情況(標(biāo)尺：100 μm)

2.3 PNS顯著調(diào)節(jié)心房組織中相關(guān)miRNAs的表達(dá) 與正常組相比，模型組心房組織中miR- 29b (A) 和miR- 328 (D) 的表達(dá)均顯著下調(diào)，miR- 210 (B) 及miR- 499 (C) 的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。與模型組相比，PNS(治療組)顯著上調(diào)心房組織中miR- 29b (A) 和miR- 328 (D) 的表達(dá)(P<0.05)；顯著下調(diào)心房組織中miR- 210 (B) 及miR- 499 (C)的表達(dá)(P<0.05)。詳見圖4。

注：與正常組相比，* P<0.05，與模型組相比，# P<0.05。

圖4 PNS顯著調(diào)節(jié)心房組織中相關(guān)miRNAs的表達(dá)

3 討 論

AF是一種最常見的快速室上性心律失常，是血栓、心力衰竭、腦卒中發(fā)生最重要的危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重影響著人類健康和生活質(zhì)量。流行病學(xué)調(diào)查指出，AF病人遠(yuǎn)期腦卒中、心力衰竭和全因死亡率風(fēng)險(xiǎn)均顯著增加。因此，AF治療藥物及其發(fā)病機(jī)制的研究依舊是目前研究的重點(diǎn)難點(diǎn)問題。PNS可預(yù)防大劑量ISO所誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠陣發(fā)性房顫的發(fā)生，與本課題組前期研究報(bào)道結(jié)果相似[5]，本次研究在此基礎(chǔ)上，結(jié)合miRNAs的研究手段進(jìn)一步探索PNS預(yù)防大劑量ISO所誘導(dǎo)房顫發(fā)生的潛在的分子機(jī)制。

miR- 29b主要表達(dá)于心肌成纖維細(xì)胞，可直接或間接參與包括膠原蛋白等在內(nèi)的多種纖維化形成蛋白的表達(dá)，抑制心肌纖維化的形成，引起心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)，是心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要標(biāo)志物[8]。且研究表明，miR- 29b在房顫或充血性心力衰竭病人呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)[9]。本研究結(jié)果提示，PNS可顯著上調(diào)心房組織中miR- 29b的表達(dá)。推測(cè)PNS可能通過調(diào)節(jié)心房組織中miR- 29b的表達(dá)進(jìn)而改善心房組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)，這可能是PNS抗ISO所誘導(dǎo)小鼠陣發(fā)性AF發(fā)生潛在的分子機(jī)制。miR- 210在缺血缺氧情況下的高表達(dá)，是諸多心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中重要的分子機(jī)制之一[10- 11]。缺血缺氧進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡是諸多疾病發(fā)生過程中最初的病理變化，細(xì)胞凋亡在生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、生理病理中起著重要的作用，同樣是心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)發(fā)生發(fā)展過程中重要的病理基礎(chǔ)。且研究表明，在心力衰竭合并房顫的病人中循環(huán)miR- 210表達(dá)顯著增加[12]。本研究結(jié)果表明，PNS顯著改善心臟組織中細(xì)胞核分裂相情況，降低心臟組織中細(xì)胞凋亡情況，下調(diào)心房組織miR- 210的表達(dá)。推測(cè)PNS降低細(xì)胞凋亡情況可能是其改善心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)，進(jìn)而防治AF發(fā)生的潛在分子機(jī)制。小電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道(small conductance calcium- activated potassium channel 3，SK3)是在房顫發(fā)生過程中起著重要作用的離子通道，且研究指出SK3基因敲除可引起小鼠其動(dòng)作電位的延長(zhǎng)進(jìn)而引發(fā)AF發(fā)生[13]。KCNN3是SK3通路上重要的調(diào)節(jié)蛋白，KCNN3在房顫發(fā)生過程中起著重要的作用。研究指出miR- 499可直接調(diào)控KCNN3以及SK3基因的表達(dá)，miR- 499通過下調(diào)KCNN3的表達(dá)，下調(diào)SK3表達(dá)，影響SK3通路活性，進(jìn)而引發(fā)房顫的發(fā)生[14- 15]。且諸多研究表明，miR- 499在房顫發(fā)生發(fā)展過程中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[16]。本研究結(jié)果表明，PNS可顯著下調(diào)心臟組織中miR- 499的表達(dá)。推測(cè)PNS抗ISO所誘導(dǎo)小鼠陣發(fā)性房顫發(fā)生的作用可能是通過調(diào)節(jié)心房組織中miR- 499的表達(dá)，改善心房電重構(gòu)而實(shí)現(xiàn)的。

諸多研究指出miR- 328在AF發(fā)生發(fā)展過程中的重要機(jī)制之一[17]。且一項(xiàng)miRNAs與AF發(fā)生發(fā)展相關(guān)性研究指出，在包含有385個(gè)miRNAs的高通量篩選中發(fā)現(xiàn)只有miR- 328不僅與AF的發(fā)生密切相關(guān)，且與AF發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)[18]。鈣離子通路在AF發(fā)生過程中同樣起著重要的作用，miR- 328可作用于SERCA2a基因，影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度以及鈣調(diào)磷酸酶蛋白的表達(dá)，影響鈣離子通路活性[19]。miR- 328還可作用于CACNA1C及CACNB1基因，影響L型鈣通道活性，影響AF的發(fā)生發(fā)展[20]。本研究結(jié)果表明，PNS可顯著上調(diào)心房組織中miR- 328的表達(dá)。推測(cè)PNS抗ISO所誘導(dǎo)小鼠陣發(fā)性房顫發(fā)生的作用可能是通過調(diào)節(jié)心房組織中miR- 328的表達(dá)，進(jìn)而改善心房電重構(gòu)而實(shí)現(xiàn)的。

PNS顯著預(yù)防ISO所誘導(dǎo)小鼠陣發(fā)性房顫發(fā)生的作用機(jī)制可能與通過調(diào)節(jié)心房組織中miR- 29b，miR- 210，miR- 499及miR- 328的表達(dá)，改善心房心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)而實(shí)現(xiàn)。這將為PNS進(jìn)一步應(yīng)用于臨床抗陣發(fā)性房顫的發(fā)生提供新的治療思路及有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] January CT，Wann LS，Alpert JS，et al.2014 AHA/ACC/HRS guideline for the management of patients with atrial fibrillation： a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines and the Heart Rhythm Society[J].Circulation，2014，130(23)： e199- e267.

[2] 楊進(jìn)剛.心房顫動(dòng)的診療與藥物治療(中國(guó)專家共識(shí))[J].心腦血管病防治，2008，8(4)：215- 222.

[3] 胡大一，郭藝芳.心房顫動(dòng)抗凝治療中國(guó)專家共識(shí)[J].浙江醫(yī)學(xué)，2012，51(23)：173- 177.

[4] 中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)心律學(xué)專業(yè)委員會(huì)心房顫動(dòng)防治專家工作委.心房顫動(dòng)：目前的認(rèn)識(shí)和治療建議- 2015[J].中華心律失常學(xué)雜志，2015，19(5)：321- 384.

[5] 賈成林，吳丹丹，李黎，等.三七皂苷對(duì)異丙腎上腺素所誘導(dǎo)小鼠陣發(fā)性房顫的預(yù)防作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(24)：2883- 2887.

[6] Sayed D，Hong C，Chen IY，et al.MicroRNAs play an essential role in the development of cardiac hypertrophy [J].Circulation Research，2007，100(3)：416- 424.

[7] Liao XB，Perez VADJ，Król M，et al.MicroRNA and Cardiovascular Disease[J].Biomed Research International，2015，2015：734380.

[8] Bingbing N，Yong Z，Dandan Wu，et al.Luteolin- 7- diglucuronide attenuates isoproterenol- induced myocardial injury and fibrosis in mice[J].Acta Pharmacol Sin，2017，38(3)： 331- 341.

[9] Dawson K，Wakili R，?rd?g B，et al.MicroRNA29 a mechanistic contributor and potential biomarker in atrial fibrillation[J].Circulation，2013，127(14)：1- 28.

[10] Karakas M，Schulte C，Appelbaum S，et al.Circulating microRNAs strongly predict cardiovascular death in patients with coronary artery disease results from the large Athero Gene study[J].European Heart Journal，2017，38(7)： 516- 523.

[11] Chen KC，Liao YC，Wang JY，et al.Oxidized low- density lipoprotein is a common risk factor for cardiovascular diseases and gastroenterological cancers via epigenomical regulation of microRNA- 210[J].Oncotarget，2015，6(27)：24105- 24118.

[12] 關(guān)添允.收縮性心力衰竭病人血漿microRNA- 210水平變化的研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2014.

[13] Tuteja D，Xu D，Timofeyev V，et al.Differential expression of small- conductance Ca2+- activated K+channels SK1，SK2，and SK3 in mouse atrial and ventricular myocytes[J].Ajp Heart & Circulatory Physiology，2005，289(6)：H2714- H2723.

[14] Ling TY，Wang XL，Chai Q，et al.Regulation of the SK3 channel by MicroRNA- 499 - potential role in atrial fibrillation[J].Heart Rhythm the Official Journal of the Heart Rhythm Society，2013，10(7)：1001- 1009.

[15] Ellinor PT，Lunetta KL，Glazer NL，et al.Common variants in KCNN3 are associated with loneatrial fibrillation[J].Nat Genet，2010； 42：240- 244.

[16] Ling TY，Wang XL，Chai Q，et al.Regulation of cardiac CACNB2 by microRNA- 499： Potential role in atrial fibrillation[J].BBA Clin，2017，9： 78- 84.

[17] Therefore.Circulating microRNAs as potential biomarkers of atrial fibrillation[J].Biomed Research International，2017，2017：7804763.

[18] Mcmanus DD，Lin H，Tanriverdi K，et al.Relations between circulating microRNAs and atrial fibrillation： data from the Framingham Offspring Study[J].Heart RhythmtheOfficial Journal of the Heart Rhythm Society，2014，11(4)：663- 669.

[19] Li C，Li X，Gao X，et al.MicroRNA- 328 as a regulator of cardiac hypertrophy.[J].International Journal of Cardiology，2014，173(2)：268.

[20] Lu Y，Zhang Y，Wang N，et al.MicroRNA- 328 contributes to adverse electrical remodeling in atrial fibrillation[J].Circulation，2010，122(23)：2378- 2387.