酯化紅曲霉的分離純化及其在固態(tài)發(fā)酵中的應用研究

單淑芳，丁 咚，趙 穎，徐 君，黃躍勇，張國強

（安徽口子酒業(yè)股份有限公司，安徽淮北 235100）

紅曲霉屬于真菌門、子囊菌亞門、不整子囊菌綱、散囊菌目、紅曲科（Monascaceae)、紅曲屬（Monascus)，是腐生真菌，能產生紅色色素，可用做食品加工中天然紅色色素的來源，如在紅腐乳、飲料、肉類加工中用的紅曲米，就是用紅曲霉制作的[1-4]。近代發(fā)酵工業(yè)用它生產葡萄酒、酒精發(fā)酵和紅曲色素，以及用于調節(jié)血脂、降低血壓等系列功能性紅曲制品等[5]。

高溫季節(jié)中的酒醅，由于環(huán)境氣溫高,一般都存在酸度高、殘余淀粉高、乳酸菌和雜菌數(shù)量多、繁殖快的現(xiàn)象,大量微生物侵入發(fā)酵體系中，影響酵母及有益菌的正常繁殖和發(fā)酵，從而導致曲酒產量和質量明顯下降。酯化紅曲是由紅曲霉等多種產酯功能菌混合培養(yǎng)制成，是復合菌劑、生物酶和活菌體的生態(tài)混合體[6]。紅曲霉具有嗜酸的特性，尤其是嗜乳酸，能夠利用乳酸為碳源繁殖發(fā)酵，解除了酸對微生物細胞的毒害作用，因而在白酒生產中能降低酒醅中乳酸和乳酸乙酯的含量；紅曲霉本身可以代謝產生己酸乙酯合成酶，加快白酒中己酸乙酯的生成速度，提高酯化率，從而達到提高優(yōu)質酒率的目的[2]。

為了改進安徽口子酒傳統(tǒng)大曲的生化性能，提高白酒的優(yōu)質品率，我公司以酯化紅曲為含菌源，分離出酯化力強的功能菌種。以此為試驗菌株，經固態(tài)純種培菌發(fā)酵，按一定比例添加到制曲原料中，制成強化大曲，或是直接與大曲混合，添加到酒醅中進行發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

原料：紅曲，某企業(yè)取樣。

儀器設備：立式恒溫生化培養(yǎng)箱，螺旋管蒸餾器，顯微鏡，高壓滅菌鍋，玻璃量筒，玻璃燒杯，三角瓶，試管，吸管，培養(yǎng)皿，酒精燈，涂布棒，安捷倫6820氣相色譜儀等。

1.2 試驗培養(yǎng)基

1.2.1 分離純化培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽浸膏30 g 、瓊脂15 g、水1000 mL、pH5.5左右、121℃滅菌15 min。

改良麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽浸膏30 g、瓊脂15 g、酒精10%vol、水1000 mL、乳酸調pH3.5左右、121℃滅菌15 min。

1.2.2 試管斜面培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1000 mL、pH值自然。

1.2.3 液體種子培養(yǎng)基

麥芽汁液體培養(yǎng)基：麥芽汁浸膏30g，水1000 mL，pH值自然。

1.2.4 三角瓶培養(yǎng)基

大米培養(yǎng)基：大米用蒸餾水浸泡24 h(米∶水=1∶1）,按每瓶50 g干料裝入500 mL三角瓶。

全麩皮培養(yǎng)基：按1∶1比例加入蒸餾水拌濕的大片麩皮，拌濕至手捏成團，松手即散為準，按50 g干料裝入500 mL三角瓶。

大米和麩皮混合培養(yǎng)基：干料大米∶麩皮為2∶1，浸泡24 h的大米和按1∶1比例加入蒸餾水拌濕的大片麩皮，按每瓶50 g干料裝入500 mL三角瓶內，混勻。

1.3 試驗工藝

紅曲酯化酶?分離?純化?母菌?斜面?液體種子?大三角瓶?紅曲擴大生產?紅曲應用于生產

1.4 試驗方法

1.4.1 紅曲酯化酶的微生物分離、純化

分離方法：稀釋涂布平板法。

純化方法：平板劃線法。

1.4.2 菌種的初步鑒定

用肉眼觀察菌落的生長、顏色、表面形態(tài)、質地、邊緣形狀等，用顯微鏡觀察菌絲、孢子和子實體結構的形態(tài)。

1.4.3 紅曲霉的斜面培養(yǎng)

培養(yǎng)條件：在無菌條件下接入紅曲霉菌種，置入生化培養(yǎng)箱內，35℃培養(yǎng)7～8 d。

1.4.4 液體種子培養(yǎng)

三角瓶液體培養(yǎng)基在無菌條件下接入試管斜面菌種，置入生化培養(yǎng)箱內，以35℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。

1.4.5 三角瓶培養(yǎng)[2]

上述3種培養(yǎng)基置于0.1MPa壓力下滅菌30min，取出冷卻至室溫搖散，使其充分吸收三角瓶壁的冷凝水，根據培養(yǎng)基的干濕情況補充含適量乳酸和乙醇的無菌水，繼續(xù)潤料30 min。

用微量移液器吸取10 mL液體種子至三角瓶固體培養(yǎng)基內，將接種好的三角瓶搖勻，然后把物料堆積在瓶的一角，以利升溫，放入32～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

當大部分物料上可看到菌絲生長時，搖瓶1次，使附在瓶壁上的冷凝水被物料吸收，然后把物料攤開，再繼續(xù)培養(yǎng)，隨時觀察曲料的干濕程度，視情況加入無菌水調濕度。

經過一段時間的培養(yǎng)，菌種發(fā)育成熟，紅曲色澤深紅，發(fā)酵均勻，無雜菌污染，有紅曲特有的曲香味。

將曲料倒出，在40～45℃下進行烘干或在太陽下曝曬，曬干后，用粉碎機粉碎，干凈塑料袋裝好，放在干燥陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6 酯化力測試

用吸管吸取1.5 mL(約1.5%）己酸于500 mL三角瓶中，再加入25 mL(約25%）無水乙醇，稍加振蕩后加入75 mL蒸餾水，充分混勻，再稱取紅曲粉10 g（絕干曲）于三角瓶中，搖勻后用塞子塞上，置于35℃恒溫箱內保溫酯化7 d。將酯化7 d后的試樣倒入500 mL蒸餾燒瓶中，量取50 mL30%乙醇溶液充分洗滌盛裝酯化液的三角瓶，將洗液一并倒入蒸餾燒瓶中蒸餾，取蒸餾液50 mL，用色譜儀分析蒸餾液中己酸乙酯含量。

1.4.7 氣相色譜條件

色譜柱：DNP不銹鋼填充柱（3 m×3 mm)，柱溫：93℃，進樣口溫度：200℃，檢測器溫度：200℃，載氣：高純氮，柱頭壓0.3 MPa，氫氣壓力：0.06 MPa，空氣壓力：0.05 MPa，進樣量為0.3 μL。

1.4.8 紅曲擴大生產[2]

大米和麩皮混合培養(yǎng)基：干料大米∶麩皮為2∶1，浸泡24 h的大米(米∶水=1∶1）和按1∶1比例加入蒸餾水拌濕的大片麩皮，按每6斤干料放入一個匾配料，用紗布包裹放在托盤中，常壓蒸1 h，然后冷卻至35℃，送入培菌室。

大米培養(yǎng)基：大米用蒸餾水浸泡24 h(米∶水=1∶1），按每6斤干料放入一個匾配料，常壓蒸1 h，然后冷卻至35℃，送入培菌室。

將托盤中的熟料均勻的鋪在培菌室的匾上，厚度3～4 cm，下鋪2層醫(yī)用紗布（已滅菌），倒出三角瓶液體種曲與物料充分混合，鋪平，接種比例25%,注意接種過程中盡量避免手與物料接觸。

接種后，保證品溫在30℃左右，每天上下午觀察室溫、品溫及物料的干濕情況，隨時調整室溫，控制品溫不要超過35℃，及時噴灑無菌水。物料色澤深紅，發(fā)酵均勻，無雜菌污染，有曲香味，說明菌種發(fā)育成熟，即可烘干，粉碎。

2 結果與分析

2.1 酯化紅曲的微生物分離結果

此次分離的培養(yǎng)基是麥芽汁培養(yǎng)基和添加了乳酸和乙醇的改良麥芽汁培養(yǎng)基，分離出了紅曲霉、根霉、毛霉、曲霉、青霉等霉菌（見表1），這說明酯化紅曲是由紅曲霉等多種產酯功能菌混合培養(yǎng)制成，是復合菌劑、生物酶和活菌體的生態(tài)混合體。

表1 酯化紅曲中分離出的霉菌

2.2 菌落形態(tài)和個體形態(tài)觀察

圖1、圖2、圖3、圖4是此次從酯化紅曲中分離出來的1號菌株和6號菌株。

在麥芽汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)1號菌株，初期為白色圓形絨毛狀，繼續(xù)培養(yǎng)菌落中央變?yōu)闇\橙色，隨著培養(yǎng)時間的變長，菌落中央的顏色越來越深，呈深橙色，背面顏色更深些，表面絨毛狀氣生菌絲，較易挑取。菌絲有橫隔、分枝，分生孢子著生在菌絲及其分枝的頂端，單生或呈鏈、球形。8號菌株和12號菌株的菌落形態(tài)與1號一致（見圖1和圖3）。

6號菌株在麥芽汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期為白色，以后呈紫紅色，色素分泌到培養(yǎng)基中，背面也是紫色。邊緣整齊，輻射狀，有皺折。表面有膜狀蔓延生長物，干燥、不易挑取。菌絲體有橫隔、分枝，閉囊殼為球形，子囊球形。分生孢子著生在菌絲及其分支的頂端，單生或成鏈、球形（見圖2和圖4）。

這些菌株形態(tài)都與紅曲霉屬菌落特征一致，應屬于紅曲霉屬的兩個種，尤其是6號菌株與紫紅曲霉的形態(tài)特征描述基本一致，如需要確定到種，還需通過分子測序技術進一步鑒定。

圖1 1號菌株宏觀形態(tài)

2.3 三角瓶培養(yǎng)紅曲酯化力測定結果

三角瓶培養(yǎng)選取大米培養(yǎng)基、麩皮培養(yǎng)基和大米、麩皮混合培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)15 d以后，曬干、粉碎，測水分、酯化力，色譜分析結果見表2。

從實驗結果看，大米培養(yǎng)基和混合培養(yǎng)基上的紅曲霉發(fā)酵產物酯化力相當，都明顯高于純麩皮培養(yǎng)基，可能是麩皮的營養(yǎng)不足以滿足紅曲霉的生長代謝。從4株菌株發(fā)酵產物酯化力來看，相同培養(yǎng)基比較，菌株之間無顯著差異。純麩皮培養(yǎng)的酯化力比外購紅曲略高，純大米和混合培養(yǎng)的酯化力顯著高于外購紅曲。

圖2 6號菌株宏觀形態(tài)

圖3 1號菌株微觀形態(tài)

圖4 6號菌株微觀形態(tài)

三角瓶培養(yǎng)選取大米培養(yǎng)基、麩皮培養(yǎng)基和大米、麩皮混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。

⑤大米培養(yǎng)基上接種的菌株3 d后，全部產紅色素或紫紅色色素。

表2 三角瓶培養(yǎng)紅曲酯化力測定結果 (mg/100 mL)

⑤麩皮及混合培養(yǎng)基1號、8號、12號菌株都長有白色菌絲，6號菌株產少量紫紅色色素。

⑤混合培養(yǎng)基長勢良好，布滿白色菌絲，到后期因營養(yǎng)匱乏，漸漸停止生長。

⑤麩皮培養(yǎng)基上菌絲長勢較弱，較開始幾天長勢緩慢，瓶壁上有小水珠生成，有可能是菌體自身新陳代謝產生的水分，所以后期不用再噴水，而需排濕。

⑤大米培養(yǎng)基到后期菌絲生長旺盛，并產大量紅色或紫色色素，從酯化力來看，大米培養(yǎng)基較適宜于紅曲霉生長，麩皮培養(yǎng)基營養(yǎng)不足以滿足紅曲霉的生長代謝，酯化力較低。隨機選取的4株菌株同培養(yǎng)基之間酯化力也無顯著差異。

2.4 第一批擴大培養(yǎng)紅曲酯化力測定結果

根據三角瓶培養(yǎng)的結果可以看出，大米培養(yǎng)基和大米、麩皮混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的紅曲酯化力較高，單純麩皮培養(yǎng)基營養(yǎng)匱乏，所以此次擴大培養(yǎng)選取大米培養(yǎng)基和混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d左右，菌絲在料中基本長透，且已產紅色色素，即已成熟，取出晾干、粉碎，做酯化力測定，色譜分析結果見表3。

此次培養(yǎng)，由于溫濕度沒有控制好，除12號菌株大米培養(yǎng)基正常發(fā)酵沒有污染外，其他所有菌株培養(yǎng)發(fā)酵的培養(yǎng)基全部都有不同程度的腐爛、發(fā)臭，晾干、粉碎后，測其酯化力，12號菌株的大米培養(yǎng)發(fā)酵產物酯化力明顯高于其他培養(yǎng)基發(fā)酵產物。從此次污染的結果也可以看出，污染越嚴重，酯化力越低，說明紅曲霉相對于其他霉菌、細菌在酯化能力上還是起到很大作用的。

表3 第一批擴大培養(yǎng)紅曲酯化力測定結果(mg/100 mL)

根據三角瓶培養(yǎng)的結果，第一次擴大培養(yǎng)選取大米培養(yǎng)基和混合培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌種仍是以上4株菌株。

在第一次擴大培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)基保濕性好，前期產熱快，說明紅曲霉在其中代謝生長快，由于沒有及時降低品溫及室溫，中后期菌絲已停止生長，物料發(fā)臭。大米培養(yǎng)基開始水分低，鎖水性差，后期培養(yǎng)過程中很容易蒸發(fā)造成水分散失，因此要頻繁觀察其干濕情況，以免影響生長，到中后期品溫突升，沒有及時降低室溫及品溫，導致此次擴大培養(yǎng)物料大多發(fā)臭，因此酯化力也相當?shù)?，只?2號菌株在大米培養(yǎng)基上培養(yǎng)沒有污染，溫濕度控制適宜紅曲霉生長，酯化力相應的要高些。

2.5 第二批擴大培養(yǎng)紅曲酯化力測定結果

第一次擴大培養(yǎng)只有12號菌株在大米培養(yǎng)基上培養(yǎng)沒有污染，長勢很好，酯化力也很高，其他都已經有污染；總體來看大米、麩皮混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的紅曲酯化力不如大米培養(yǎng)基培養(yǎng)的好，所以此次全部選用大米培養(yǎng)基培養(yǎng)，色譜分析結果見表4。

此次擴大培養(yǎng)，在第一次失敗的基礎上，總體來說溫濕度控制還不錯，酯化力測試結果都挺高。比較各菌株在大米培養(yǎng)基上的發(fā)酵產物，1號菌株和6號菌株己酸乙酯都在790 mg/100 mL左右，12號菌株和混合菌株己酸乙酯都在850 mg/100 mL左右，相對于同等條件下的外購紅曲均高很多。

表4 第二批擴大培養(yǎng)紅曲酯化力測定結果(mg/100 mL)

綜合三角瓶培養(yǎng)和第1次擴大培養(yǎng)的紅曲酯化力發(fā)現(xiàn)，大米培養(yǎng)基是較適宜紅曲霉生長的培養(yǎng)基，第2次擴大培養(yǎng)全部選用大米培養(yǎng)基培養(yǎng)。

大米要蒸透，軟而不黏，剛接種時室溫不能太高，由于培養(yǎng)基溫度高，若室溫也高，加上菌種自身生長代謝產熱，容易導致品溫上升過快，菌絲剛長出又因溫度高而被抑制。漸漸地大米會在高溫環(huán)境中慢慢腐爛，培養(yǎng)基中氧氣漸漸變少，新長出的菌絲也因無氧氣及高溫而被抑制生長。因此，接種后的第2天要根據品溫及時地調整室溫。掌握好這一點，后期主要觀察其干濕情況，調節(jié)干濕度。5～6 d的培養(yǎng)，曲外觀色澤鮮紅或白色，手抓起來很輕，有特有的曲香味，即已成熟，取出，晾干，粉碎，做酯化力測試，色譜分析結果顯示，酯化力比外購紅曲要高出2倍多。

3 結論

此次試驗以酯化紅曲為含菌源，分離純化出酯化力強的功能菌種紅曲霉。經形態(tài)觀察，初步確定此次分離出的紅曲菌種為兩種紅曲霉。選取其中4株為試驗菌株，在不同的培養(yǎng)底物中，經固態(tài)純種發(fā)酵制成固態(tài)紅曲，從氣相色譜儀測定其酯化力大小來看，大米較適宜于紅曲霉生長代謝。在用大米作為培養(yǎng)底物時，大米要蒸透，軟而不黏，剛接種紅曲霉時，要注意室溫的控制，根據品溫情況及時調節(jié)室溫，掌握好這一點是重中之重，后期主要觀察其干濕情況，調節(jié)干濕度。另外，從三角瓶培養(yǎng)和第2次擴大培養(yǎng)結果看，選取的4株菌株同培養(yǎng)底物之間酯化力無顯著差異。

接下來的試驗要看在酒醅中能否提高出酒率，達到“增己降乳”的效果，如果一切順利，則本試驗應該針對紅曲霉的培養(yǎng)條件、酯化過程條件控制等方面繼續(xù)進行研究。

[1]胡曉龍,趙東,葛隱,等.五糧液大曲中產酯化酶紅曲霉的分離及酯化酶的純化[J].釀酒,2011(3)：35-38.

[2]程江紅,何汝良,程江浩,等.酯化紅曲工藝研究及在釀